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1、1. 凝胶柱层析法(盐酸小舞碱固体脂质纳米粒的制备)其原理是运用分子筛效应：一个含有各种分子的样品溶液流经色谱柱时，各分子在柱中进行着两种不同的运动:垂直向下的移动和和无定向的运动。大分子物质由于直径较大，不易进 入凝胶颗粒的微孔，而只能分布在颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较 快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔 中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从凝胶内扩散到间隙后再进入另一 凝胶颗粒，如此不断的进入和扩散，小分子物质的下移速度小于大分子物质，从 而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出， 这种现象为分子筛效应。固体脂质
2、纳米粒混悬液中的游离药物可以渗透到凝 胶孔穴中而晚些被洗脱出来，固体脂质纳米粒由于粒径较大，不易或不能进入 凝胶内部，因此优先被洗脱出柱。采用凝胶柱层析法分离 BH-SLN与游离BH, RP-HPLC法测定包封率与 载药量。1.1 BH-SLN与游离BH的分离纳米粒与游离药物的分离以凝胶层析柱为分离介质，采用梯度洗脱技术进行分离。1.1.1分离条件层析柱：Sephadex-G50葡聚糖凝胶ft (1cm x 25cm)；上样量0.5ml；梯度洗脱条 件：pH7.4PBS容液洗脱，洗脱速度为 1ml min-1。1.1.2分离方法Sephadex-G50葡聚糖凝胶预处理称取4g葡聚糖凝胶G-50
3、于烧杯中，加过量蒸僻水于沸水浴中溶胀 2小时。倾 泻烧杯除去上层漂浮的细碎凝胶，重复 3-4次。操作中避免剧烈搅拌，防止破坏 其交联结构。(2)层析柱制备a. 安装与检查：检查出口装置中尼龙绸完好十净。安装层析柱，让其垂直 固定于滴定台架上。对准出口处，放一只 250ml烧杯。向层析柱内灌洗脱剂 PBS打开出口螺旋夹，层析柱无渗漏，出口乳胶管通畅。b. 排气泡：保持柱内一定的水位，排气完毕，保留柱内1-2cm高水位，关 紧螺旋夹。c. 标记高度：在距顶端8-10cm处做一标记，作为衡量灌装层析介质床体高度（15-17cm）的依据。装柱用50ml烧杯取溶胀的凝胶悬:浆25-30ml,静置片刻，凝
4、胶沉淀与水的体积 之比为1:1。轻轻搅匀杯中凝胶，用玻璃棒引流入柱，打开出水口，并不断地向 柱内补充凝胶，直到凝胶沉淀高度位于标记上方约2cm为止，凝胶柱内没有气泡和断层，柱床表面平整。平衡取15ml洗脱剂PBS用滴管沿柱内壁旋转着缓缓流下，不可冲动胶平面， 打开出水口，经洗脱液的流动，活洗内壁使胶床收紧。洗脱平衡完毕，胶床上方 保留约4cm高水位，使胶床高度15cm,关闭出水口。（5）上样与收集打开出口排水，当胶床与上方水层的弯月面相切时，关闭出口，用滴管将 0.5mlBH-SLN液沿柱内壁缓缓加入，勿冲动胶面。上样完毕，打开出水口，开始 收集，每管收集洗脱液2ml。采用自动部分收集器每1m
5、in分段收集洗脱液，分别 测定在345nm处的光密度值，作洗脱曲线。载药纳米粒和药物的洗脱曲线见图1-5 结果显示，载药纳米粒可以和游离药物达到良好分离。（6）层析柱再生处理把凝胶倒出，用6mol/L脉浸泡凝胶半小时，抽滤，再用水漂洗数次，除净 脉，必要时重复上述操作即可重新使用。1.2包封率、载药量测定采用RP-HPLC&测定包封率和载药量。取0. 5 mlBH-SL启上述凝胶柱分离，将分离出的游离药部分用0. 2 m微孔滤 膜过滤，采用RP-HPL8法，分别测定总BH-SLNO游离BH-SLN的包封率和载药 量。按照中国药典（2005版）固体脂质纳米粒包封率的计算公式计算包封率，
6、包封率（ER,%） =W、-W游/W总X 100 %。式中 W总表示总药物含量，W游表示游 离药物量。载药量（DL,%）=W、-W游/WcX 100 % 式中Wc为混合脂质用量。2. 低温超速离心法（伊曲康哇固体脂质纳米粒的研究）通过改变g值可以分离各种类型纳米粒混悬:液中游离药物。用 0.1mol/L盐酸 调节固体脂质纳米粒混悬液pH至1.2。使固体脂质纳米粒絮凝，离心，纳米粒在离 心管底部，上活中含游离药物，使游离药物和固体脂质纳米粒分开。量取ITZ-SLM昆悬液适量,加0.1mol/L Hcl调至pH约1.2,使纳米粒絮凝，然 后丁 4C超速离心(15000r/min)15min，将上活
7、液定量稀释；另精密量取ITZ一 SLN 适量加甲醇破坏后，用甲醇定量稀释，然后采用紫外分光光度法丁 262nm处分别 测定上活液和总药的吸收度，计算伊曲康哇的浓度，按下式计算药物包封率：包封率=C息一勺扎X 100%c总其中：c国为上清液中测得的药物浓度.C两ITZ-SLN测得的药物浓度，3. 透析法该法是将固体脂质纳米粒装入透析袋中，在室温条件下，不断更换外部介质， 在10-24h内可除去95%以上的固体脂质纳米粒中的游离药物。此法的优点是不 需要复杂昂贵的设备，能除去几乎所有的游离药物。称取一定量的ITZ-SLNM干粉，以加入等量水溶性赋形剂、调解等渗的20%乙 醇溶液为水合介质水合至10
8、0ml，即时取样2ml破乳定容至I0ml，UV法测定总药物 浓度C总，共取3份测定，取平均值。以此纳米粒混悬液为外相，取3个透析袋，分别 移取20%乙醇2ml等渗液，置丁其中作为内相。同时以磁力搅拌器搅拌，达到平衡 时间(6h)以后，分别取各透析袋内透析液20ml，用20%乙醇等渗液稀释1倍，UV法 测定,计算游离药物的浓度，算得各透析袋所测浓度的平均值C游，纳米粒的包封率 (EE%为:EE%=(500C、-200C游)/500C 总 X100%透析法和凝胶过滤法实验用时较长，实验操作复杂，实验用品较贵。低温超速 离心法操作简单，用时较短，比较经济实惠，且操作在低温下进行，固体脂质纳米 粒不易被破坏。因此本实验采用低温超速离心法测定包封率。