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1、精品文档细胞因子检测细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类生物活性物质分泌的蛋白质 ,在体内广泛参与免疫调节及炎症反应、组织修复、刺激造血系统、刺激细胞的增殖与凋亡等重要生理活动,?在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中均起重要作用。某些刺激因子也可导致一些细胞因子超量表达,或表达减少 ,从而参与疾病的发病及病理过程。1、免疫学检测法其基本原理是将细胞因子作为抗原进行定量检测。?如免疫斑点法、 ELISA 法、 RIA 法和免疫印迹法等均已用于细胞因子的检测。2.、生物学测定法其原理是根据细胞因子对特定的依赖性细胞株(即靶细胞 )?的促增殖作用 ,以增殖细胞中的DNA 的合
2、成或酶活性为指标 ,间接推算出细胞因子的活性单位 ,如对 IL-1 、 IL-2 等细胞因子活性的检测。亦可根据某些细胞因子对特定靶细胞的杀伤效应或对病毒的抑制作用进行测定,如对肿瘤坏死因子及干扰素的生物活性测定。3、分子生物学测定法目前采用的技术有各种印迹法、斑点杂交、原位杂交和PCR 等。通过检测细胞内细胞因子的基因组成或mRNA 量 ,推算出细胞因子的合成量。精品文档精品文档一、 IL-1 的检测 (生物活性测定 )产生 IL-1 的细胞种类很多 ,其中最主要的为单核 - 巨噬细胞。 IL-1 可分为 IL-1 (?也称酸性 IL-1,pI=5.0) 和 IL-1 (中性 IL-1,pI
3、=7.0) 。两者的分子量和生物活性相似 ,?只能用抗体检测方法才能区别 ,常用的生物学测定法对两者都适用。 IL-1?的生物学活性广泛 ,其检测方法亦较多 ,包括有小鼠胸腺细胞增殖法、 D10G 4.1 细胞增殖法及 L929 细胞增殖法等。IL-1 反应细胞增殖可以通过活性染料染色 ,显微镜直接计数 ,3H-TdR 或 125I-UdR 的 DNA 掺入量或以活性细胞代谢率为指标来表示。本试验介绍 L929 细胞增殖 MTT 比色法。（一） IL-1 的诱生体外试验可用 LPS 等有丝分裂原诱导单核 - 巨噬细胞产生 IL-1, 或用P388D1( 鼠),THP-1( 人)细胞株制备 IL
4、-1 。本试验以小鼠巨噬细胞制备IL-1 。1、取 610 周龄 BALB/c 或 C57BL/6 小鼠 ,雌雄均可 ,拉颈处死后用酒精消毒。2、用带 9 号针头的 5ml 注射器腹腔注入5ml 冷的含 5小牛血清的 Hanks 液(5?NBS-HBSS),轻揉腹部吸出腹腔液体 (内含腹腔细胞 ),反复抽吸几次。3、1500r/min离心 8min, 洗细胞 2 次。精品文档精品文档4、将腹腔细胞用含10 小牛血清的 RPMI-1640液(10 NBS-RPMI-1640)配成 2 ×106/ml, 加到 24 孔平底培养板 ,1ml/ 孔 ,置 5 CO2,37 温箱孵育 2h 。
5、5、每孔用 5 NBS-HBSS 洗 3 次,弃去未粘附细胞 ,贴壁细胞为巨噬细胞单层。6、将 LPS(10 g/ml) 加入巨噬细胞单层 ,每孔 1ml, 培养 4h ；加入 10 NBS-1640?1ml 继续培养至 48h, 收集上清液 ,置-20 冰箱保存 ,待测 IL-1 活性及含量。（二） L929 细胞增殖 MTT 比色法MTT 比色分析法的原理是利用四甲基偶氮唑盐3-(4.5-dimethylthiazol-2-y1)-?2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT)在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下,被还原成兰黑色的MTT- 甲 ,形成 MTT-
6、甲的量与细胞增殖程度呈正相关。 ?故通过测定细胞形成MTT- 甲 量,可间接定量分析细胞的增殖情况 ,具体步骤如下 :1、将生长成单层的L929 细胞用 0.25 胰酶消化 2 3min 。除去消化液后 ,用10% FCS 的 RPMI-1640将 L929 细胞配成 1 ×105/ml, 加入 96 孔细胞培养板中 ,每孔 100 l。2、取 100 l 不同稀释度的 IL-1 标准品和待测品 ,分别加入各孔中 ,每孔设 3 个复孔 ?,置 37 ,5% CO2 温箱孵育 56h 。精品文档精品文档3、用 PBS 溶解 MTT 为 5mg/ml,用 0.22 m 膜滤器除菌及杂质。
7、4、上述培养体系取出后 ,每孔加入 10 l MTT(5mg/ml),37继续培养 4h 。5、从每孔吸出 100 l 上清弃去 ,加酸化异丙醇或加DMSO 100 l/ 孔,?充分混匀以溶解底物。酸性条件使培养液中酚红指示剂变为黄色,以利于对 MTT- 甲 转化物的测定。6、将微量测定板置室温数分钟,保证转变的底物结晶被溶解。7、用酶标光度计以检测波长为570nm, 参考波长为 630nm分别测量 OD 值。测定应在酸化异丙醇加入后1h 内完成。OD570nm OD 630nm, 再减去培养液对照的 OD 值。8、用 IL-1 标准品各稀释度IL-1 含量 (X) 和各稀释度对应的OD 值(
8、Y)作直线回归 ,按上述概率单位分析法计算待测样品IL-2 的活性单位 (u/ml) 。（三）注意事项1、IL-1 诱生剂的浓度 ,培养条件和细胞浓度对结果均有明显影响,?应进行预试验以确定最佳实验条件。精品文档精品文档2、培养器皿和研磨条件：24 孔培养板培养细胞活率较高,但生长稍慢。玻璃瓶培养有时会因玻璃质量和清洗不净引起细胞死亡,故应注意采取相应措施。?大量培养时用大容量瓶比较方便,可减少操作中的污染。研磨组织可用玻璃匀浆器、不锈钢网。二、 TNF 的检测 (免疫学测定法 ,双抗体 ELISA 夹心法 )（一）原理 选用两种针对 rHuTNF- 分子不同表位的单克隆抗体 ,一种单克隆抗体
9、作为包被抗体 ,另一种单克隆抗体作为酶标抗体,如果待测样品中含有TNF- ,则形成抗体 -TNF- - 酶标抗体复合物 ,通过酶催化底物显色 ,亦可根据标准品OD值绘制标准曲线 ,?从标准曲线上查出待检标本中TNF- 的含量。（二）材料和试剂1、包被抗体 : 使用时用包被缓冲液作适当稀释。2、酶标抗体 : 使用时用稀释液作适当稀释。3、标准品 : rHuTNF- (10ng/ml),使用时用稀释液作倍比稀释。4、阴性对照液 (未免疫鼠 Ig) 。精品文档精品文档5、ABTS 底物 :2,2'-Azino-bis-(3-ehtylbenzthiozoline 6-sulfonic aci
10、d)?,?2,2'-连氮基 - 双(3- 乙基苯并噻吡咯呆 -6 磺酸 )。6、96 孔 ELISA 板。7、0.15mol/L,pH7.4 PBS:配其它液体用。8、包被缓冲液 : 0.05mol/L,pH9.6 Na2CO3-NaHCO3缓冲液。9、洗涤液 : 0.05 Tween 20-PBS 。10 、稀释液 :4 PEG-洗涤液 (用于稀释标准品和酶标抗体)。11 、底物缓冲液 :0.1mol/L,pH5.0柠檬酸 - 磷酸氢二钠缓冲液。12 、3H2O2 。13 、血清、枸缘酸盐或EDTA 抗酸血浆、其它体液及细胞培养上清均可检测,?后者应作适当稀释。14 、ELISA 读
11、数仪等。精品文档精品文档（三）操作步骤1、包被将稀释好的包被抗体加入ELISA 板 ,100 l/ 孔,4放置 24h 或 48h 。2、加待检标本洗涤液冲洗ELISA 板 3 次,加待测样品、阴性对照及倍比稀释的标准品 ,100 l/ 孔 ,37 ,1h. 标准品稀释方法 :取标准品 150 l(10ng/ml)倍比稀释 7个浓度 :5ng/ml 、2.5ng/ml、1.25ng/ml、625pg/ml、312pg/ml、 156pg/ml和78pg/ml。3、加酶标抗体 :洗板 3 次 ,加入稀释好的酶标抗体 ,100 l/ 孔 ,37 ,1h 。4、显色 :洗板 3 次 ,加入配好的 A
12、BTS 显色液 ,100 l/ 孔,室温或 37 显色 15 30min 。5、ELISA 读数仪测 410nm 处 OD 值 ,绘制标准曲线。6、从标准曲线查得待测样品中的TNF- 含量。四、注意事项精品文档精品文档1、血清或血浆中残存凝块或红细胞须经离心去除,勿用溶血或脂肪过多的血清。2、标本在 2 8 可储存 3 天,超过 3 天应放入 -20 或 -70 ,避免反复冻融 .3、分别用加样器头吸取各份标本,避免相互交叉。4、叠氮钠 (NaN3) 对辣根过氧化物酶 (HRP) 有灭活作用 ,在本实验系统中应避免使用。5、底物显色液必须临用时配制,双氧水应放置在2 8,保存 6 个月以内。附
13、 : 试剂配制1. 0.15mol/L,pH7.4 PBSKH2PO4 0.2gNa2HPO4 ·12H2O 2.9gNaCl 8.0gKCl 0.2g精品文档精品文档双蒸水加至100ml2. 包被缓冲液Na2CO3 1.59gNaHCO3 2.93g双蒸水加至1000ml3. 洗涤液PBS 1000mlTween 20 0.5ml4. 稀释液洗涤液 100ml鸡蛋清0.6ml精品文档精品文档PEG (聚乙二醇 ,MW6000) 2.0gNaCl 2.9g5. 底物缓冲液Na2HPO4 ·12H2O 1.79g拧檬酸1.29g双蒸水加至100ml6. ABS 显色液ABTS
14、 5mg底物缓冲液10ml3H2O2 20 l三、 IL-2 的检测 (基因的检测 )精品文档精品文档细胞因子基因的检测包括对其DNA 的检测和 mRNA 表达的检测 ,常用的方法有Southern印迹 ,斑点印迹 ,PCR,原位杂交及原位 PCR 等,Northern印迹及RT-PCR。本文介绍 IL-2mRNA的测定 (斑点杂交法 )。将 RNA 变性后直接点样于硝酸纤维膜上 ,可用手工操作点样 ,?也可用斑点式点样器点样,再与特异性探针进行杂交。 ?本法可用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及半定量分析。由于其操作比 Northern印迹简单、迅速 ,所需样品量少 ,且可在同一张膜上同
15、时进行多个样品的检测 ,故很适合于临床应用。 亦可用于 DNA 的检测。但其缺点是不能鉴定所测基因的分子量。（一）主要试剂1. RNA 提取试剂 :TRIZOL 试剂 (Gibcol,No.15596-026),DEPC水(Fluka,No.980210)2. 质粒提取试剂盒 :(Promega:Wizard Minipreps DNA,No.117)3. DNA 片段提取试剂盒 :(La Jolla)4. 地高辛标记和检测试剂盒 :(Boerhinger Mannheim,No.1093657)5. IL-2 DNA 探针精品文档精品文档6. 其他试剂（ 1) STE 溶液 0.1mol/L
16、 NaCl10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)（ 2) 溶液 50mmol/L 葡萄糖25mmol/L Tris.Cl(pH 8.0)10mmol/L EDTA(pH 8.0)可配 100ml, 高压灭菌 15min, 贮存于 4（ 3) 溶液 0.2mol/L NaOH( 临用前用 10mol/L 贮存液稀释 )1%SDS ( 配 20% 贮存液 )盖紧瓶盖 ,颠倒离心瓶数次 ,以充分混匀内容物 .于室温放置 5 10min精品文档精品文档（ 4) 溶液 5mol/L 乙酸钾 60ml冰乙酸11.5ml水 28.5ml所配成的溶液对钾是3mol
17、/L , 对乙酸根是 5mol/L（ 5) 含相应抗生素的LB 培养基（ 6) 氯霉素 (0.25g/2ml)->终浓度 170 g/ml（ 7) 溶菌酶 (10mg/ml, 溶于 10mmol/L Tris.Cl pH8.0) 1ml（ 8) 无水乙醇 (部分 -20 预冷 ).异丙醇 .75% 乙醇 (部分 4 预冷 )（ 9) TE 缓冲液 (pH8.0)（ 10)5mol/L LiCl 1.5ml（ 11)RNA 酶,RPMI-1640, 胎牛血清 (FCS),ConA( 刀豆蛋白 A)等精品文档精品文档（ 12)500 l 含 13%(W/V) 聚乙二醇 (PEG 800) 的
18、 1.6mol/L NaCl（ 13 ）3mol/L NaAc 、饱和酚、氯仿 :异戊醇 (24:1)（二）主要仪器CO2 培养箱 :美国 Forma Scientific产品 ;无菌操作台 :苏州净化设备公司产品 ;图象处理分析仪 :同济医大太阳公司产品 ;低温高速离心机 :上海离心机械研究所 .（三） IL-2 质粒 DNA 探针的大量制备1、含 IL-2 质粒 DNA 探针的提取取含 IL-2 质粒 DNA 的单个菌落置两个25ml LB 培养基 (含 100 g/ml Amp)37 220r/min振摇过夜 (约 16h)精品文档精品文档取 10ml 菌液加 200ml LB 培养液
19、(含 100 g/ml Amp)37 150r/min振摇 4h加氯霉素 (终浓度 170 g/ml)37 220r/min振摇 3h菌液倒入 300ml 离心管中离心4 5000r/min×10min离心弃上清除去残液 (吸水纸无菌 )每管加 40ml STE 溶液 (冰预冷 )悬浮细菌后 ,用移液管转入到 50ml 离心管中4 5000r ×15min 离心弃上清 ,加 5ml 溶液 (冰预冷 )悬浮细菌 ,加 1ml 新配制 (pH8.0) 的溶菌酶(10mg/ml)轻摇,室温静置 5min加 10ml 溶液 ,盖上盖子 ,将离心管小心颠倒数次混匀液体,不要用旋涡振荡
20、器精品文档精品文档冰浴10min, 且勿摇动加 7.5ml 溶液 (冰预冷 ),轻振荡离心管数次使之混合冰浴20 30min, 使沉淀完全 ,4 12000r/min×20min离心取上清到另一 50ml 离心管中 ,加 0.6 体积异丙醇 ,混匀 ,室温静置 15min室温 5000r/min×15min 离心弃上清用 75% 乙醇洗涤沉淀一次 (不将沉淀悬浮 ),倒出乙醇 ,倒置吸水纸上 ,使乙醇挥发用 1.5mlTE(pH8.0) 将沉淀溶解 ,加等体积冰预冷的 5M LiCl, 混匀后置冰浴10min4 12000r/min×10min 离心取上清至新 E
21、P 管, 加等体积的异丙醇 (约 3ml), 充分混匀 ,室温静置 15min室温 12000rmin×10min离心 (回收沉淀的核酸 )精品文档精品文档小心去上清 ,将管倒置以使最后残留的液滴流尽,用 75% 乙醇洗涤沉淀 ,流尽乙醇 ,?用吸纸吸去附于管壁的液滴,将管倒置在纸巾上数分钟,以使最后残余的痕量乙醇蒸发用 500 l TE(pH8.0) 溶解 DNA 沉淀 ,移至新 EP 管中 ,加入 RNA 酶 (终浓度 100 g/ml)37 水浴 30min加等体积 (500 l)含 13%(W/V)PEG(800)的 1.6mol/L NaCl,充分混合4 12000r/mi
22、n×5min 离心吸去上清 ,用 400 l TE(pH8.0) 溶解质粒 DNA 沉淀加等体积饱和酚 (400 l)混合12000r/min×10min 离心吸上层水相移至另一EP 管 ,加入等体积酚 :氯仿 :异戊醇 (25:24:1) 剧烈混匀呈乳白状精品文档精品文档12000r/min×10min 离心吸上层水相移至另一EP 管 ,加等体积氯仿 :异戊醇 (24:1) 混匀12000r/min×10min 离心吸上层水相移至新EP 管(硅化 ),加入 0.1 体积的 3mol/L NaAc(pH5.2)和 2 体积的 -20 预冷的无水乙醇 ,混
23、匀 (可见沉淀出现 ),置-20 2h 或 0 20min4 12000r/min×15min 离心弃上清 ,加 75% 乙醇 (4预冷 )200 l,稍加振荡 ,离心洗涤 2 次4 12000r/min×5min 离心去上清敞开管口 ,将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽溶沉淀于 11 l TE 溶液中取 1 l 电泳 其余进行酶切精品文档精品文档2.、经 0.7 琼脂凝胶电泳 ,确定有质粒 DNA 后,用 XhoI 进行酶切。酶切反应体系 :质粒 DNA 10 lXhoI 6 l10*Buffer(H) 6lDW 38 l-总体积60 l 37 消化过夜3.
24、用 WizardTMPCR纯化试剂盒回收IL-2 DNA片段1)将 60 l 酶切反应体系经1% 琼脂糖凝胶电泳2)紫外灯下切下IL-2 DNA片段 ,挑出凝胶到 EP 管中 ,加 1mlResin使凝胶溶化精品文档精品文档3)用 5ml 一次性注射器将Resin/DNA mix转移到 WizardTM Minicolumn中,用 2ml80% 异丙醇洗涤 Minicolum,12000g离心 20s, 加 50 lDW 到Minicolumn中,12000g离心 20s,?收集 DNA 。（四）用 DNA标记和检测试剂盒对IL-2 探针进行地高辛标记?地高辛是一种仅存在于洋地黄类物质花叶中的
25、类固醇半抗原,又称异羟基洋地黄毒甙配基,地高辛精可以通过一个11 个碳原子的连接臂与尿嘧啶核苷酸嘧啶环上的第5?组碳原子相连接形成地高辛精标记的尿嘧啶核苷酸,Boehringer Mannheim公司出售的地高辛精标记核苷酸有?dig-?UTP,dig-dUTP, 和 dig-ddUTP, 它们分别适用于RNA 探针 ,DNA 探针和寡核苷酸探针的标记。地高辛精标记核苷酸主要通过酶反应标记核酸探针 ,用标记探针做原位杂交 ,杂交体用特异性抗地高辛精抗体通过免疫组化技术检测。在适宜的标记反应条件下,一般每 20 25?个核苷酸中带有一个标记的核苷酸。 这一标记密度最利于半抗原与碱性磷酸酶标记的抗
26、地高辛精之间的反应。因为一个标记抗体大约复盖20 个核苷酸。Boehringer Mannheim?公司生产的地高辛精DNA? 标记试剂盒和地高辛检测试剂盒在分子杂交中的应用愈来愈广泛。现介绍地高辛标记cDNA 探针随机引物延伸法。1.、将 DNA(1 g 3 g) 加热 95 (或 100 ) 10min, 随即在冰 /NaCl 中骤冷。DNA 充分变性对探针标记十分重要。5 l 对照 DNA 作为对照。精品文档精品文档2、将离心管置于冰上 ,按顺序加入下列试剂 : 1g 3 g 新鲜变性 DNA; 2l?六聚核苷混合物 (试剂 5); 2l dNTP 混合物 (试剂 6), 加入蒸馏水使总
27、体积达到19 l,?再加入 1 l Klenow聚合酶。3、离心片刻后 ,将离心管置 37 恒温箱内孵育60min 。延长孵育时间可长达20h,可使标记量增加。4、加入 2l 0.2mol/L EDTA (pH8.0 )终止酶反应。5、加入 2.5 l 4mol/L LiCl和 75 l 预冷 (-20 )的乙醇 ,混匀置 -70 30 min或?-202h, 使标记探针沉淀。6、离心 (16500r/min),弃上清液 ,用 50 l 70 冷乙醇轻洗沉淀物。7、将沉淀物置于真空干燥仪内干燥后,溶解于 50 l TE 缓冲液 ,-20 冰箱保存。（五）培养细胞RNA 的提取 (采用 Triz
28、ol 试剂盒提取 RNA)1、收集培养细胞 ,用 RPMI-1640培养液离心洗涤3 次,第二次离心洗涤时用RPMI-1640培养液调整细胞数至5×106 1×107 细胞。精品文档精品文档2、最后一次洗涤时吸1ml 细胞悬液至 1.5mlEP 管中 ,在台式离心机离心 ,弃上清 ,加入 1mlTRIZOL 试剂 ,用移液器轻轻吹打细胞数次,充分混匀 ,室温 (15 30 )静置 5min 后 ,加入 0.2ml 氯仿 ,快速摇动 15s, 室温静置 2 3min 。3、于 28 离心 14600r/min×15min, 上层无色水相 (RNA 溶于此层中 )?约
29、占整个细胞匀浆液的60 。4、小心吸取其中400 移至另一 Eppendorf管中 ,加入 0.5ml 异丙醇 ,轻柔混匀 ,?室温静置 510min 后。5、于 28 离心 14600r min ×10min, 在管壁下底处可见一乳白色小沉淀块,即为 RNA 。弃上清。6. 用冰冷的 75 乙醇 1ml 洗 RNA 沉淀 (不用吹打沉淀 ),然后于 2 8,11500r/min离心 5min, 去除上层乙醇后于无菌环境(或真空 )风干 RNA 沉淀 ,但不要使沉淀过于干燥 ,以免影响 RNA 的溶解 ,用 20 l DEPC 处理的双蒸水溶解RNA 沉淀。置 -80 冰箱备用。（六
30、） RNA 的斑点杂交1、RNA 变性： 20 l RNA溶液（ 2g RNA ）精品文档精品文档4l 20 ×SSC14 l 37%甲醛 （formaldehyde）40 l 100% 甲酰胺-60 温育 30min, 水浴冷却样品在上述 RNA 液体中每 100 l 液中加 210 l 20 ×SSC(共 310 l),每孔加 150 l。2、纤维素膜处理过程： 硝酸纤维素膜（0.45 m ）水中浸泡 min, 再用 20 ×SSC?室温浸泡 h 。3、滤器的处理及点样：用0.1N NaOH浸泡（洗）多孔过滤加样器 ,?再用灭菌水彻底冲液。将纤维素膜压在多孔加
31、样器的上层板的上面,再压在下层板上 ,赶去气泡 ,?然后两部分夹紧 ,点样前 ,先用 20 ×SSC（200 l）洗一遍每个孔 ,真空抽吸干净后 ,再分别点样。如有未点样孔须用 150 l 的 20 ×SSC 封住其孔 ,然后用真空泵抽吸干净 ,再用 20 ×SSC 清洗一次 ,待流体滤过纤维膜后 ,继续抽吸 min 以干燥滤膜。精品文档精品文档4、取出膜 ,80 烤 2 3h, 膜保存于 -20 配 20 ×SSC 标准柠檬酸盐 pH 7.0NaCl 175.3gNa.Citrat 88.2g（柠檬酸钠）H2O至 1000ml用 10N NaOH or
32、 10N HCl调 pH 至 7.0, 高压消毒1N NaOH约 0.5ml5、杂交(1) 预杂交1)预杂交液： 5 ×SSC, 0.75%(W/V) 封闭剂 , 0.1%(W/V)N-lauroylsarcodine,?0.02%(W/V) SDS2)先将预杂交液热至60 。精品文档精品文档3)将带有目的 RNA 的硝酸纤维素膜放入稍宽于滤膜的塑料袋,?加入预杂交液 ?,?按每 100cm2滤膜加 20ml 。4)尽可能除净袋中的空气,用热封口器封住袋口 ,将其置 60 水浴过夜 ,?其间不断翻动塑料袋。(2) 杂交1)杂交液 (DIG Easy Hyb(20ml/100cm2)预温轻振荡 30min2)将标记探针 DNA(5 25ng/ml)煮沸变性 5min, 迅速置冰水中冷却 ,3)加入到预温的DIG Easy Hyb(2.5ml/100cm2)中混合 ,避免形成汽泡4)然后每张膜上注入预杂交液和滴加探针/DIG Easy Hyb5)振荡孵育至少6h, 在微量 DNA 时,建议 16h, 使其杂交。6)2 ×SSC,0.1SDS 清洗 2 次,每次 5min, 室温。7)68 振荡条件下 ,0.1 ×SSC, 0.1 SDS 清洗 2 次 ,每次 15min 。精品文档精品文档（七）免疫测定