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1、复杂样品的分离分析引言：随着现代科学技术的进步，尤其是分子生物学和计算机的推动，当前分析科学取得长足的进步，各种新的分析仪器和方法无论在适用性和灵敏度方面都有很大的发展.过去需要几年才能测定的蛋白质结构，现在几个小时就可以迅速测定，人类基因图谱的完全测定曙光已在眼前。采用高效毛细管色谱（包括毛细管电泳）很快分离上百个成分已不是困难的 事，色谱和各种结构测定手段的在线联用，使得无论对已知化合物的在线监测，还是对未知混合物的分析能力都大为增强。目前分析化学正在生命科学、环境科学、材料科学、药物学等前沿领域发挥极大的推动作用.但是随着这些学科的不断发展，分析样品正变得越来越复杂。分析任务也变得越来越
2、艰巨.进入21世纪，人们将逐渐告别单一组成的分析，越来越多地面临复杂样品的分离分析，组成一结构一功能将是人们关心的焦点，复杂样品将是摆在人们面前的分析难题.复杂样品分析的基本思路复杂样品是指组分种类多、含量差别大、已知信息少.几乎为一黑箱的复杂混合物。 这样的样品在生物、 环境、材料中占大多数.例如中药提取物或环境污染物.来源于自然界，常常含有从无机到有机、从离子性、强极性到非极性、从小分子到大分子、从位置异 构体到对映体、从常量到痕量的上百种成分，而且这些成分大都是未知的.即使是曾被发现的成分，也很难获得纯品或对照品，与大量未知物混于一体，无异于未知化食物。复杂样品的分析，首先需要弄清组成这
3、一样品体系的各种组成及其比例关系，了解组成这一体系的基本组分分布，在此基础上，还需对每一组成进行详细了解，如结构确定， 为最终阐明组成一结构一功能提供依据（或根据组成一功能关系.先确定有效组成，再确定这些有效组成的结构）.因此，对复杂样品的分离分析，可按三个层次进行研究：（1）利用高效色谱进行复杂混合物的系统分离分析，获得基本组成色谱峰及其比例关系：（2）混合物组成成分的结构鉴定，这包括离线各种光谱、质谱的综合鉴定及色谱和各种技术的在 线联用，尤其是联用技术不仅可以进行快速签定，而且由于减少了处理步骤，避免了处理过程造成的组分损失，因此具有更高的定量可靠性，对含量少的组分也可以进行定性（这些含
4、量少的组分是比较难于得到纯品的）；（3）尽管高效色谱和各种光谱、质谱的联用技术可以极大地促进复杂混合物的分析，但应该看到联用技术一般要求色谱能分离获得纯色谱峰，才能较好地获得其光谱、质谱，进行较好的分析.由于样品组分复杂，在实际分离中 即使采用多柱系统在最优化条件下，仍会有大量的不同程度重叠峰，因此，利用先进的算法和计算机，结合色谱和各种光谱、质谱规律，进行多维分析信号与信息的综合处理，解决重叠峰的解析和定性、定量，最终完成复杂样品的分析任务.复杂样品组成的多模式多柱色谱及联用技术的综合分离分析对于复杂样品的分析，尽管现代高效色谱拄具有很高的柱效，借助于计算机模拟、优 化可获得极佳的分离效果，
5、但由于样品几乎包含各类化合物离子性、强极性、中等极性、弱极性、对映体、挥发油类、大分子、金属离子和微量元素等，解决此类复杂体系的 分离分析，仍需要发展智能多模式多柱系统（1MM1CC）以及色谱与其它技术的联用.这是因为对于不同的色谱模式. 各有其内在的优点，它们各自都有解决特定分离问题的优势.因此利用不同色谱模式、 不同柱子的特性和优势，取长补短，可以利用不同柱子对样品组分的选择性、互补性来达到单模式、单柱子色谱系统所不能解决的分离问题智能多模式多柱系统及其联用技术包括高效液相色谱（服LC）、气相色谱（GC）、毛细管电泳（CE）和各种联用技术等众多于段，它利用计算机技术并结合了色谱专家的知识和
6、经验，是智能的、统一的分析方法.1对一些极性有机溶剂提取物可以综合考虑不同液相色谱方法进行分离分析通常对于未知复杂混合物的分析，首先采用合适的溶剂进行溶解或提取其中成分进行分离分析研究.根据样品不同性质可以来用不同极性的溶剂进行溶解和多步提取，获得其一种或多种样品成分对于所获得的组分，应尽量进行简单的处理，减少成分损失.利用简单浓缩，然后过滤宣接利用色谱进行分离分析，充分发展色谱方法，进行复杂混合物的分离 分析不失为一种高效的方法.对于未知的复杂样品提取物，可以根据提取溶剂进行方法的 初步发展.对于极性溶剂提取物一般可以利用目前应用比较成熟的反相液相色谱进行分 离.柱子选择以 Cls柱为主，根
7、据分离情况可以进行不同C18柱及C8柱及苯基拄组成多柱系统进行互补分离.一般Q s填料装填好，技效高，适用性广，与其它填料相比，Qs填料对各类样品均有较强的适应能力，因此可以以q8柱作为第一柱.从色谱填料的发展来看，采用少含金属离子高纯硅胶基质作原料，键合相均匀，封尾好，残余硅经基少，碳含 量高（16%）是目前校子发展的主要方向.另外，细管径、细粒径填料（如3仰）可以获得更高的拄效，具有更强的分离能力，这些都十分有利于复杂样品的分离分析.在柱子确定 之后，流动相的选择是影响分离的最为重要的因素，流动相选择的目的是使所有组分流得出、分得开、分析时间最短.甲醇冰体系以其选择性好.价格便宜，应用最为
8、广泛，可以 作为未知化合物分离时选择流动相的第一选择.除此之外，可以选择乙腊休、四氢映喃冰 进行互补分离，并可采用异丙醇/ P醇分离部分强保留成分，所有这些流动相可以组成多 二元流动相进行互补分离对于用纯水溶解或提取的样品常常含有强极性、离子性化合物，对于这些化合物的分离分析*在常规反相色谱中会几乎不保留，因而没有分离效果.对于这些成分的分析应考 虑调节流动相的 pH值、利用反相离子对色谱进行分离分板.比较常用的方法是控制pH值在酸性范围（pH值2 5），并利用十二烷基磺酸钠、庚烷磺酸钠等进行方法初步发展， 根据实验结果进行相应调整或多种途径互补分离2. 对于有一定挥发性的化台物应优先采用气相
9、色谱进行分离与液相色谱相比较，气相色谱具有快速、准确、分离效率高、检测灵敏度高，一次 测定能得到多种组分的定量结果等众多优点，因此对子有一定挥发性的样品应尽量利用气 相色谱进行分离分析.对于非极性溶剂（如石油酰）提取物，主要以非极性化台物为主，可以利用气相色谱进 行分离分板.并且可以首先选择一根非极性的柱子（如DB 1）进行分离.然后选用极性稍有差别的弱极性柱（如皿一5）作为第二根柱进行双柱分离，甚至再选一根极性住进行非常 复杂混合物的多柱互补分离.在每一根柱子上都需要选择最佳的分离条件.充分发挥其柱效，并实现互补分离.3. 毛细管电泳应作为液相色谱补充和发展毛细管电泳，又叫高效毛细管电泳（比
10、）（五），是近年来发展最快的分板方法之一毛纫管电泳是经典电泳技术和现代微住分离相结合的产物，其优点可概括为三高二少，即高灵敏度、高分辨率、高速度、进样少、溶剂用量少.与液相色谱类似.毛细管电泳也有多种 操作模式，即毛细管区带电泳（CZL）、胶柬电动毛细管色谱（M薨CC）、毛纫管凝胶电泳（cGE）、毛细管等电聚焦（C12F）、毛细管等速电泳（CIEF）及毛细管电色谱（LKL）.目前，毛 细管电泳在生命科学中已广为利用，但随着胶束电动毛细瞥色谱、毛细瞥电色谱等技术的迅速发展，毛细管电泳在有机物的分折应用也正逐渐展开.将毛细管电泳与液相色谱结合的新型色谱技术一一毛细管电色谱具有液相色谱的分离机理，但
11、由于其采用电场驱动流动相代替压力驱动流动相，在很大程度上消除导致柱效降低的扩散因素，因此具有更高的柱效，目前这一研究正以极快的速度迅速发展.毛细管电泳将以其超强分离能力及样品和溶剂消耗低等优点，在复杂样品的分折中扮演越来越重要的角色.4. 色谱和其它结构测定技术的联用是解决复杂样品分板的强有力的手段色谱的优势在于分离，在常规的紫外检测器上对于无紫外吸收化合物的检测和大量未 知化合物的定性分析还须依赖于其它分板手段.色谱和质谙的联用是目前最受重视的手 段，除传统的气相色谱一质谱联用 （G（）MS）夕卜.进入90年代液相色谱一质谱联用（LC MS） 的发展最为引人注目.这是因为比MS不完全同于GG
12、MS*其M5应是软的多级质谱（MSI） 而90年代发展的大气压下的液相色谱和质谱的联用接口电喷雾接口（踢1）和大气压下化学电离接口 （APCI）正是两种软电离的接口，并且在很大程度上解决了使用LC MS时对液相色谱流动相的限制（如对纯水和流速的限制）.灵敏度也得到很大提高.采用软电离技 术.主要产生的是“拟”分：严离子峰，进一步使用多级质谱，可以很好地对未知化合物 的结构进行研究.利用 Ms M5进行选择反应临测（sRM）,则具有很高的选择性，因而具 有很好的定量灵敏度和可靠性.目前这一技术也成为发达国家药物质控的热门手段除液相色谱和四级杆质谱的联用之外，利用大气压下的接口， 液相色谱、毛细管
13、电泳和最新发展的正交飞行时间质谱和离子陕质谱也实现了成功联用.不仅如此，相比较基质辅助飞行时间质诺，基于电喷雾接口的液相色谱一正交飞行时间质谱联用（如L（汀，队Q Tof）不仅能对色谱流出组分进行高灵敏度检测，而且能进行准确的分子量测定，从而可能宜接给出化合物的分子式液相色谱一离子阱质谱联用（如LQ）可以容易地进行多级质诺测定，从而确定其分子量和相关的结构信息.因此，液相色谱和质谱的成功联用不仅对以解决色谱难于解决的化合物的定性问题，而且也将为质诺的分析提供极大的方便和灵活性，为质诺提供更加广阔的应用前景，为复杂样品的分析提供强有力的手段.色谱和各种质谱、 核磁共振等定性手段的联用是当前仪器分
14、析的重要发展，除色一质联用外，气相色谱和红外光谱（GC-FTIR）、液相色谱和核磁共振也实现了联用 （LC-NMR）.液扣色谱一核磁共振一质诺联用仪 （比NMR / MS）也已应用于研究中. 复杂样 品多模式色谱及其联用技术综合分析的流程如下：、大分子强极性 中等栈性L非概性多糖蛋白质HPLC图1复杂样品多模式多综合分析流程图三.复杂样品分析的理论基础对于复杂的未知样品，除了充分利用先进的仪器，采用多模式色谱及其联用技术进 行综合分析外，还与发展与之相关的色谱分离、定性及重叠诺峰的解析方法等，进行充分的理论基础研究.1 .色谱方法发展及优化色谱方法发展及优化指的是对于复杂未知样品先初步确定其基
15、本分离条件（如模式、柱子、流动相等），然后对此方法进行优化，如流动相的多台阶多二元的智能优化.从而使得 在绘定的柱系统和最佳的流动相梯度下，样品组分获得较好的分离，分桥时间最短，同时色谱峰高增加，检测灵敏度也相应地得到提高.对于未知样品的优化策略是将未知样品转化为已知样品，弄清样品组分的保留值规 律，从而利用计算机进行智能优化.即通过跟踪不同条件下色谱峰流出次序，同时获得各组分的保留值及峰形参数，进一步利用这些参数通过保留值方程和峰形变化规律，采用计算机进行分离条件的选择和模拟实验，获得其最佳分离条件.未知样品转化为已知样品的关键是如何获取组分的保留值方程早在80年代，卢佩章提出，针对不同的最
16、难分离物质对，应采用多阶梯度进行优化 的思想.张样明将这一思想用于环境样品中大气毒物的人工干预智能优化，取得了很好的效果.吕美玲结合多二元流动相和台阶梯度的优点，提出多台阶多二元智能优化的设计思想，并用于多环芳烧的分离， 取得较好的效果采用多台阶多二元的智能优化方法，一方面可以扩大流动相的范围（选择性和冲洗强度），满足分离要求，另一方面优化针对性强， 容易难确找到最优点， 而且实现简便.因此，多台阶多二元的优化策略为复杂体系的优化 开辟了新天地.在环境污染物多氯联苯（P帕）和中药黄茂分析中，两个优化结果如图2及3所示1008060>£402020406080100120140t
17、R (min)图-2多氯联苯（PCB）的分析00.000. 122B. 091077L 3977一8593.3L408.77 )24.23 139.6956, Q784.04112,01139.99tR(min)图3中药黄氏的分析柱子：Spherisorb LC-18 (5 m);流动相：从纯水，甲醇 /水到70%异丙醇/甲醇的多台阶双二元流动相梯度洗脱；流速：1ml/min ;检测：200-400(UV).每秒一次PDA紫外扫描，并于203nm下提取色谱图。2. 多维联合定性复杂样品的分析结果是一个巨大的多维信息库，其中包括色谱、质谐和光谱方面的 大量信息.需要采用多维数据处理的方法和理论对
18、大量数据进行处理，进行多维联合定性，并且采用不断发展的计算机技术和化学计量学手段，通过对大量信息的提取、 加工，形成统一的数据库.尽管色谱定性相对不足，但利用气相色谱的Kvoat指数和液相色谱的a, c指数定性.再结合其它定性手段还是有一定特色的例如尽管色谱联用时质诺在很大程度上解决色诺定性上的不足,但质谱很难对异构体则进行定性；相反, 有些异构体很容易被色谱分离，因此，联合定性可以很好地解决这一问题.另 外，液相色谱和光电二极管阵列紫外扫描捡测器的联用已成为一种很常用的仪 器，色谱和紫外单独定性较差，但二者的联合定性可以提高其可靠性.通过预 测保留范围后.再匹配光谱或质谱可以大大缩小匹配范围
19、，从而增加定性的可靠性3. 重叠谱图的解析及色谱置叠峰的拟合定量复杂样品，由于其组成极其复杂，组分间的交叉重叠会十分严重：一方面，要进行操 作条件的优化，使组分获得尽可能的分离；另一方面，还应认识到，对于复杂样品的分离 分析，即使在优化的条件下，色谱峰的重量还是不可避免的.因此，发展计算机拟合技术 进行重叠谱峰的解析是十分必要的.例如，对于中药提取物，包含不同种类、异构体等多 种化合物，其色谱峰必然会发生严重的交叉重叠，因此，中药的色谱分析面临的是大量重 叠峰的定性、定量.对于重叠谱的解析，一方面要充分利用化学计量学的方法进行色谱、 光谱解析，发展各种谱的综合解析方法，另一方面，还要更深入地认
20、识色谱峰形规律、质 谱规律等谱学规律， 利用规律解决问题.目前基于色谱动力学所进行色谱峰形预测和重叠 峰的解析已可以很好地拟音色谱峰，但这一规律还需进一一步结合质谱等谱学规律，共同解析重叠谱，以获取重叠组分准确的定量面积四.在中药质量控制中的应用影响中医药学的应用和发展、尤其是中医药进入国际市场的极为重要的因素是中药的质量问题.目前所用的质量控制方法只测定少数成分来控制中药质量，由于中药发挥疗效的物质基础是中药的有效成分，而一味中药中的有效成分可能是几种成分，也可能是几十种成分甚至更多.因而目前中药的质量评价和质量控制尚缺乏可靠、合理、有效的方法，中药 质量控制只有首先解决这一复杂样组分分析，才有可能建立其质量标准。图4中药质量控制研究方法蔡少宵等认为，应该研究阐明优质药材所具有的特定的整体化学信息，以它为标准进行质量检测，就可以实现对药材的真正客观、可靠、合理、有效的 质量评价和质量控制，以达到质量标准化的目标，并提出研究建立”中药智能 全息库”的设想，其核心内容之一是复杂中药提取物的分析.其具体研究思路如图4如示.五.结语20世纪人类对自然界的认识获得了很多突破性进展， 但有人认为人类对复 杂系统的认识还很肤浅.进人 20世纪，人类将面临各种复杂体系的认识，复 杂体系的研究是人类面临的难题， 首先摆在分析化学家面前的将是复杂样品的 分析问题.