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1、多管发酵法测定水中大肠菌群、目的要求1. 学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法2. 了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性。二、基本原理多管发酵法包括初（步）发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。1. 初（步）发酵试验发酵管内装有乳糖蛋白月东液体培养基， 并倒置一德汉氏小套管。乳糖 能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产 酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有漠甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。 漠甲酚紫还有抑制 其他细菌如芽胞菌生长的作用。水样接种于发酵管内，37C下培养，24小时内小套管中有气体形成， 并且培养基混浊，颜色改变，
2、说明水中存在大肠菌群，为阳性结果，但也 有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能 完全说明是阴性结果。在量少的情况下，也可能延迟到48小时后才产气， 此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做下面两部分实验， 才能确定是否是大肠菌群。48小时后仍不产气的为阴性结果。2. 平板分离平板培养基一般使用复红业硫酸钠琼脂（远藤氏培养基，Endd smedium）或伊红美蓝琼月旨（eosin methylene blueagar , EMBagar）,前 者含有碱性复红染料，在此作为指示剂，它可被培养基中的业硫酸钠脱色， 使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛
3、即和复红反应， 形成深红色复合物，使大肠菌群菌落变为带金届光泽的深红色。业硫酸钠 还可抑制其他杂菌的生长。伊红美蓝琼脂平板含有伊红与美蓝染料， 在此 亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时， 该两种染料即结合成 复合物，使大肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金届光泽的深紫色（龙胆紫的紫色）菌落。初发酵管24小时内产酸产气和48小时产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。3. 复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落,经涂片染色为革兰氏阴性无芽胞杆菌者,通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸乂产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。三、器材乳糖蛋白月东发酵管（内有倒
4、置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白膘发酵管 （瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水；载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌试管等。四、操作步骤1. 水样的采取同实验五十九。2. 自来水检查（1）初（步）发酵试验在2个含有50ml三倍浓缩的乳糖蛋白月东发酵 烧瓶中，各加入100ml水样。在10支含有5ml三倍浓缩乳糖蛋白月东发酵 管中，各加入10ml水样（如图X IV -1 ）。混匀后,37C培养24小时，24 小时未产气的继续培养至48小时。（2）平板分离经24小时培养后，将产酸产气及 48小时产酸产气的 发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上， 再于37C下培养18 24小时
5、，将符合下列特征的菌落的一小部分， 进行涂片，革兰氏染色， 镜检。（a）深紫黑色、有金届光泽。（b）紫黑色、不带或略带金届光泽。（c）淡紫红色、中心颜色较深。（3）复发酵试验经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽抱杆菌， 则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白月东发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落 1 3个，37 C培养24小时， 结果若产酸乂产气，即证实有大肠菌群存在。证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表X IV -2,即得大肠菌群数。表MV-2大J&菌群巷数表接种水样总星罚。血(100nJ2 , IDmllD愣)水量免阳性管数10m
6、l水是的阳性菅卜、012每升水样中大肠菌也摭篷升水祥中烦菌群数每升水祥中大肠菌群数0_< 341113S132713273113341424530北6.22369272T43120&3151演193&6023010如69> 2303. 池水、河水或湖水等的检查(1) 将水样稀释成10-1与IO2。(2) 分别吸取1ml10-2、10"的稀释水样和1ml原水样，各入装有10ml普通浓度乳糖蛋白豚发酵管中。另取10ml和100ml原水样，分别注入装有5 ml和50ml三倍浓缩乳糖蛋白豚发酵液的试管(瓶)中。(3) 以下步骤同上述自来水的平板分离和复发酵试验。(
7、4) 将100、10、1、0. 1 (10-1) ml水样的发酵管结果查表XIV -3, 将10、1、0. 1 (10-1)、0. 01 (10-2) ml水样的发酵管结果查表XIV -4, 即得每升水样中的大肠菌群数。表XIV-3大筋茵群松数表接种水样总星 111.1ml （ lOOml、 10ml、 1ml： Ulrnl各 1 份）接种水样髭（ml ）每升水样中大肠菌群数1001010.1< 9一+9+9+MB95+18十十19+22+一23+厘十+92十十94+180+230+一+960十+十2380十十十+> 2380“卜'大觞菌群发酵阳性： 大肠菌群发酵阴性.表m
8、-4大麻苗群检教表接神水样总量11.11血(10. 1. 0.1 > DJ01赫咎1愣接种水样最(词)每升水样中 太麟菌群毂.10.10.10.01< 90.+90+第4-.P5+18C十一十19C-FH-獭4.23C十+2 EC十十920叶十9404+1SOO4十23004+5600+十十238C0十十十十238C0_W粮酵阳性:J发酵阻性.五、实验报告1.结果(1) 自来水100ml水样的阳性管数是多少？10m l水样的阳性管数是多少？查表XI V -2得每升水样中大肠菌群数是多少？(2) 池水、河水或湖水阳性结果记“ +” ；阴性结果记“-”。查表XI V -3得每升水样中大肠菌群数是多少?查表XI V -4得每升水样中大肠菌群数是多少?水样菅 < 血1)发酵姑果1001010J012.思考题(1) 大肠菌群的定义是什么？(2) 为什么要选择大肠菌群作为水源被肠道病原菌污染的指示菌？(3) EMEBt养基含有哪几种主要成分？在检查大肠菌群时，各起什 么作用？(4) 经检查，水样是否合乎饮用标准？