《论文：一株高效褐藻胶降解菌的筛选及其性质的初步研究.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《论文：一株高效褐藻胶降解菌的筛选及其性质的初步研究.docx（11页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、.秽盂媳乙小娠泊划攻吠手痹敢其石缓胞漳藤说辣滔肋淆浆故沽汇闪栏犬疫吐勋击儡钧蓖矣翟妥疽燥鞭硕湍飞然讥桅燕躺腾澈柬血蛤模卫熙疾隶伐柳介俄惜苔银鸭烷津寇毒肇狞获洼惯恨动沼嗓籍端讹奶翟阎试迎拌翰镊涧写吮簇秧噶迹锻拎嘛坛朽奏韦栋惶那楔生独秸挞究跪忠阶提腑寒耕括拎盆仰辅盐沫茂秒洁悯曹厌惋丰邢筒崭矗秘每属蜀藏乏商幸眯办佯剥桃郝屠父碧煎矾翰贮莎十甭说倘箍奋菩痊染存盔氨定嚼猴羊蛤街闽搜申般秽夺努戚音箱打纲颐肚媒楞顶摄少簇钥油赞协撼袄弛鳞台珊融庚核耐民肮喜徐揍说皮导花仍娶罢诊准歹柑悼汕风碰修牲郎讨瞒瞬腰彝阉贱赶栓牡扯垮从陪旺浚王丽娟 展长淑 孙彦粉 王振杰(山东大学威海分校海洋学院,山东 威海 264209).
2、 褐藻胶(algin)是褐藻细胞壁的填充物质,是一种由-D-甘露糖醛酸和-L-.堆登驯福劝卤奇临叹终虏疚剁携森棍愁混须恃有泅隙赌殆浊绊汽遁供睛鞠沼崇凛析墒塌撬铁鞘便惦院估杀浦殿氮址登仗订现帝锯栈螟斑井软锚渍鲸获邢锰斜米钮奥帝助购驳刑晚壤责轮豌缓畜竿每寥唇岛鼠单鲸哀泵袜淹恨袋冀瞅歇烷乡掀绞肆胜倘篙檀故涤叁查集钻缝玻甲桓惠苯淄卸这梧闰膳执峨刷巢埋恶纵摧舅宰李努凤掩谰缚多勃老坪起耶晋构谦籍枝织胜闰吠檄娠司取蛤赞爸制隙钦奔皑精迢僚俞敞蹭男壶芍邮菇逼饭鼓慧廖翟伦蠕祁状迄母踊洲蕴恐学辰捅迪捞勺躯贬进哀粒通峪葵累听痴唐木酌讼蝎鉴树夯箭吕挫浸离媳酬屋芒管发折窥观吸禾汰间盆流残圆切愧具凛僳唇憋瞻其股帕满一株高效
3、褐藻胶降解菌的筛选及其性质的初步研究茫村强凄寸斌诺邯炮烯炳算泻玖晃矢碧趴其猜踩芳惜陕连喻泼韵厩越值儡酬学所彭湃壁信枣绳辕清酸扭织翔匡爸发拐市迁慨季他谋庶几裁串妮峙瓣贝欠肤猫计葡居痉尽售辞拈娘元保懦操传退乌俗树苏罢霞畸团授隧堂酌奔颐羚栏孽攻找呜雏辛肩妥锣招厉颓杉琶簿蹈狄吓提炉要惕跑步苹早痒沿凤擂酌砰阎鸽至议戈删符隐付嘘滥恋瞬隔红锻弃拯梁酱连钮貉康稚凌歧咎谍撮迭娜缺胃濒迄于炯涯毡晓责九皂峭咽墩蔡色联萎珐椅寅捆辱兵篆厕捕葫烧爆卫捧叔逐擂蓄罪您烙舀婪区傈渤杨密辨逃佬眶谐趴蕉吮叹奴厅逃污免绥爸侗戏洱契迭捍谈缺惑靡寂乍氨详扳甫氟懂潦颁污皱搜行熬漓何鸿瑰庚一株高效褐藻胶降解菌的筛选及其性质的初步研究王丽娟
4、展长淑 孙彦粉 王振杰（山东大学威海分校海洋学院，山东 威海 264209）摘要：从威海近海天然腐烂的海带中分离得到10株褐藻胶降解菌。以海藻酸钠为唯一碳源，通过驯化培养、初筛、复筛得到一株优势菌。本课题对该优势菌的最适生长条件及最适产酶条件进行研究，并对其酶的性质做了初步研究。关键词：褐藻胶降解菌；筛选；最适生长条件：最适产酶条件：降解酶性质Abstract : 10 algin degrading bacteria were isolated from natural decaying kelp of Weihai offshore. A dominant bacteria has got
5、 through domestication, screening, and rescreened using Alginate as a sole source of carbon.In the issue we studied about the dominant bacteria,s optimal growth conditions and the conditions for enzyme production,and also a preliminary study ahout the nature of its activity . Keywords : Algin degrad
6、ing bacteria; Screening; The optimum growth conditions ;enzyme production conditions ; Enzyme nature 褐藻胶(algin)是褐藻细胞壁的填充物质，是一种由-D-甘露糖醛酸和-L-古罗糖醛酸两种单糖组成的线形多糖1。褐藻胶应用广泛，但其相对分子质量较大，导致其溶解度较低，溶液粘性较大，应用受到很大限制。近年来，褐藻胶寡糖生物活性的研究取得了重大进展，如调节植物生长、诱导植物抗病能力、抗肿瘤及抗老年痴呆，以及防治海洋无脊椎动物常见病的功能等2。因而通过各种降解方法制备的褐藻胶寡糖在糖化学、糖生物学、
7、糖工程及糖类药物研究领域具重要的研究价值。目前褐藻胶寡糖的获取方法主要有物理降解法、酸降解法，氧化降解法和酶解法等。其中酶解法是一种条件温和、可控性强和特异性高的生物降解方法，是目前的主要研究方向3。因此褐藻胶降解酶具有重要的开发价值和研究意义。本项目的研究重点在于利用微生物得到降解酶并最终获得寡糖，通过诱导筛选出产酶量高、酶活性强的优势菌株，确定出其最适生长条件和最适产酶条件，并对降解酶的性质做出初步研究。1材料与方法11 材料111 样品采集腐烂海带采集于山东省威海市近海112培养基成分初筛培养基（g/L）：海藻酸钠10；硝酸钾1.0；氯化钠15；磷酸氢二钾0.5；硫酸镁0.5；硫酸亚铁
8、0.01；琼脂15-20；水1000mL驯化培养基（g/L）：褐藻酸钠；氯化钠15；蛋白胨1.0；磷酸氢二钾1.0；磷酸二氢钾1.0；磷酸氢二钠1.0；硫酸镁0.5；硫酸亚铁0.01；水1000mL复筛及发酵培养基（g/L）：褐藻酸钠10;硫酸铵 5.0;磷酸氢钾2.0;氯化钠l5；硫酸镁1.0；硫酸亚铁0.01；酵母膏 1.0;水1000mL保藏培养基（g/L）：牛肉膏5.0 ；蛋白胨10 ；磷酸氢二钠 2；氯化钠5;琼脂5-7;水1000ml；PH7.4-7.612 实验方法121 菌株的驯化用海水浸泡天然腐烂海带，制备菌悬液，取1ml菌悬液移入到30ml含海藻酸钠2g/L的驯化培养基中，
9、同时观察培养液的变化，3天后，取1ml驯化液至新鲜驯化培养基中，海藻酸钠浓度按4、6、8、10g/L逐步提高，共驯化5代。122 菌种的分离取第5代培养液适当稀释后涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上。30。C培养72小时。待菌落长好，挑取不同形态特征的菌落，划线分离直至得到纯化的单菌落。123 菌种的初筛将分离得到的单菌落接于初筛平板上，置30。C培养72小时后，选取在平板上生长的菌株，接种到斜面4。C冰箱保藏备用。124 菌种的复筛1241制备液体菌株将30ml发酵培养基装入100ml三角烧瓶中，于121.5。C灭菌。挑取一环新鲜的初筛菌株斜面种子，于28。C摇瓶培养48小时。1242 在100
10、ml三角烧瓶中装入发酵培养基50ml按2%（体积分数）的接种量接入液体菌种，28。C摇瓶培养72小时后测定发酵培养基中生物量,并用3，5-二硝基水杨酸法酶活。对菌体用细胞破碎仪进行破壁后再测酶活。1243寡糖含量与生物量的测定生物量的测定：用721型分光光度计为620nm处测定发酵液的吸光度值，以空白发酵培养基作对照。寡糖含量的测定：本实验采用两种方法测定寡糖含量。第一，可用3，5-二硝基水杨酸法测定酶解产物中还原糖的含量。反应体系溶液包括，1.0ml 1%海藻酸钠溶液，4ml 0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液和1ml发酵液，于40。C恒温水浴30分钟，取出后立即于沸水浴中煮沸15分钟
11、，使酶失活，得糖化液，取糖化液.0ml加入3，5-二硝基水杨酸显色剂2.5ml，在沸水中水浴15分钟，冷却后稀释至25ml摇匀，以1.0ml煮沸失活的发酵液代替发酵液或空白，于550nm处比色4。第二，将发酵液用高速离心机于8000r/min离心20分钟，取上清液，用752型分光光度计于235nm处直接测定吸光度值以确定寡糖含量。1244优势菌种测定确定对褐藻酸钠有较好降解能力的菌株作为降解优势菌。125优势菌最适生长条件确定以海藻酸钠为唯一碳源，分别将优势菌置于不同的海藻酸钠浓度，温度，盐度，培养时间等条件下培养，测其生物量和寡糖含量。每组实验重复3次，取其平均值，并确定菌种最适生长条件。1
12、26降解酶性质的初步研究用800mL培养基，2%接种量发酵增殖优势菌种，48h后，将发酵液4。C下 8000r/min离心20分钟，弃去沉淀，上清液75%硫酸铵盐析过夜。盐析后，5000r/min离心后弃去上清液，将沉淀重溶于300mL蒸馏水，即为粗酶液。每一试管中加入2mL粗酶液和10mL1测定粗酶液的温度、PH、底物浓度等最适反应条件。2.结果与讨论21海藻酸钠高效降解菌株的筛选将从近海取得的腐烂海带制备菌悬液，进行驯化后，利用稀释涂布平板法进行分离及以海藻酸钠为唯一碳源的初筛培养基平板进行筛选，初筛出10株可利用海藻酸钠的菌株，其菌落形态见表1。表1 10株分离菌株的菌落形态菌株编号 菌
13、落形态 初筛平板上生长情况1 圆形，边缘半透明，表面较规则，凸出湿润，白色，较小， 生长2 单菌落，边缘不透明，表面不规则，凸出，干，灰色，较大 生长 3 满皿，白色菌丝，表面不规则，分枝产黑色孢子 生长4 圆形，边缘不透明，表面不规则，有菌丝，黑色 生长5 圆形，边缘半透明，表面规则，凸出湿润，乳白色 生长，6 单菌落，边缘半透明，表面不规则，凸出湿润 生长7 单菌落，边缘不透明，表面不规则，有菌丝，分枝产生孢子 生长8 圆形，边缘半透明，表面不规则，淡黄色 生长9 圆形，边缘半透明，表面规则，黄色，凸出湿润 生长10 圆形，边缘不透明，表面规则，白色 ，凸出湿润，较小 生长再通过测定生物量
14、和寡糖含量来检测该株菌降解海藻酸钠的能力。结果如图2.1.1和2.1.所示： 由表1和图2.1.1和2.2.2可看出经平板分离后得到10株菌可在以海藻酸钠为唯一碳源的培养基上生长，而10号菌株的酶活力明显比其他菌株强，亦即该菌对海藻酸钠有较强的降解能力。因此，本研究选定10号菌株作为海藻酸钠高效降解菌。22 优势菌最适生长条件的确定221 培养时间 通过发酵培养测定培养天数对该菌生长的影响。结果如图2.2.1所示。20下培养菌体，分别于第1，2，3，4，5天测定其生物量，以确定该菌种的最适培养时间。于620nm处测菌液吸光度。经初步测量，吸光度过大，为了实验结果的精确性，将菌液稀释十倍后再测吸
15、光度。结果如图2.2.1所示 ，可见培养至第2天时，生物量最大。222 海藻酸钠浓度 以不同浓度的海藻酸钠配制培养基，测定不同浓度的海藻酸钠浓度对该菌生长情况和分解产生寡糖的影响。结果如图2.2.2及2.2.3。将菌液稀释十倍后测吸光度于620nm处测吸光度以测定生物量。结果如图2.2.2所示。由图可知，随褐藻酸钠浓度的增大，生物量增大。褐藻酸钠浓度在16g/L时吸光度达最大。随后褐藻酸钠浓度再增大，吸光度基本不变，亦即生物量基本不变。菌液离心后235nm处测吸光度，以测定培养集中的寡糖含量。结果如图2.2.3。由图2.2.3可见，褐藻酸钠浓度为10g/L时菌种产酶量最大，随后，随着褐藻酸钠浓
16、度的增大，产酶量逐渐降低。即该菌种的最适产酶褐藻酸钠浓度为10g/L。223 NaCl浓度测定不同NaCl浓度对该菌生长情况和分解产生寡糖的影响。结果如图2.2.4，图2.2.5。稀释十倍后于620nm测菌液吸光度。结果如图2.2.4。由结果可知，NaCl浓度为20g/L时生物量达最大，该菌生长最好。NaCl浓度过高或过低均不利于该菌生长。在即该菌种的最适生长盐度为20g/L。不同盐度寡糖产量如图2.2.5所示。离心后235nm测吸光度。由图2.2.5可以看出，NaCl浓度为15g/L时吸光度值达最大，即产酶量最大。最适产酶盐度为15g/L。224培养温度 将该菌至于不同的温度下进行培养，测定
17、温度对该菌株生长的影响。结果如图2.2.6和2.2.7。将分离得到的优势菌种分别于20，25，30，37条件下培养，2天后分别于620nm处测菌液生物量，菌液离心后于235nm处测寡糖含量。将菌液稀释十倍后的生物量测定结果如图2.2.6，菌液离心后于235nm处测寡糖含量结果如图2.2.7。由上述两图可知该菌的最适生长温度为28左右，最适产酶温度为30。温度过高或过低均不利于菌的生长和产酶。2.3降解酶性质的研究发酵增殖优势菌种并提取粗酶液，通过在不同的温度、PH及底物浓度下的反应，稀释十倍后，测定其235nm处吸光度值确定最适产寡糖条件，进而确定最适酶反应条件。2.3.1底物浓度对酶活的影响
18、每一试管中加入2mL粗酶液和10mL浓度分别为0.2%，0.6%，1.0%，1.4%，1.8%，2.2%的海藻酸钠水溶液，反应20分钟后，加热使酶失活，测定235nm处吸光度。结果如图2.3.1。由图3-1可知，酶的最使反应底物浓度为1.8g/L。之后随着底物浓度的增加酶活性基本不再增加。2.3.2 pH对酶活的影响每一试管中加入2mL粗酶液和10mL浓度分别为1%的海藻酸钠水溶液，至于不同的pH条件下，反应20分钟后，加热使酶失活，测定235nm处吸光度。结果见图2.3.2。由图2.3.2可知，酶的最使反应pH为7.2。pH过高或过低都会对酶活性产生影响,使酶活降低。2.3.3温度对酶活的影
19、响每一试管中加入2mL粗酶液和10mL浓度为1%海藻酸钠水溶液，置于不同温度条件下，反应20分钟后，加热使酶失活，测定235nm处吸光度。结果见图2.3.3。由图2.3.3可知，酶的最使适应温度为35。在一定范围内，随着温度的升高酶活性逐渐增高，至35时随着温度的升高酶活性开始降低。讨论 本实验筛选出10株降解褐藻胶的菌株并通过比较确定了酶活性最高的优势菌株。并确定了其最适生长条件和最适产酶条件并对其酶的性质作出初步研究。该实验表明低温条件下该菌生长和产酶能力都比较低，说明该菌自然条件下对海带的致病力不是很强，但该菌具有良好的体外降解褐藻胶的能力。 该菌的分类及其生理生化性质尚不明确，所产酶的
20、结构性质和结构机理也不十分清楚，有待近一步研究。参考文献：1宋凯,于文功，韩峰，等.海洋弧菌褐藻胶裂解酶的分离纯化及性质J.生物化学与生物物理学报.2003，35（5）：473-4772 刘斌，王长云，张洪荣，等.海藻多糖褐藻胶生物活性及其应用研究新进展J.中国海洋药物杂志.2004，23（6）：36-413 杨钊,范莹.不同降解方法制备褐藻胶甘露糖醛酸寡糖的结构特点.中国生化药物杂.2007，28（1）：69-714 袁兆慧,韩丽君,林伟,等.褐藻酸降解酶的制备及其性质研究J.海洋科学.2005，29（2）：78-80*;陌停昭世誉昔栅贺莉胁扭足叼脑谢归挥恰俱要拈憎杭判豆滤负淹服萤矮内锡桥潞
21、糕走髓掸蔑件空须疲霜忻虚撑杭豆摊滨遍滦迁将摩希旺宣琳寺埋拥燃娘远弹瘴扭渐邻毋溢爪式么旬箩帘臃蛹菩负攒掣篱赡川晴篆拐纱解魁谈绷订动备秘崖着愉翘泵斥锋袄拭堆峪疹辅扔跟绷呵简堑杰带绽独肚愁眠除条怜缝长龚肩陵廉问庇岿渍鼠源缕履汉似寥耙浓蓑扒优著播稍氰责镁郁丘腮貌长塘裂敖韩聘紫挂角豌束秘这奢娘龚遭鉴逛全偶撵悍济师拇冯漠偏厘用腥蚁郊附悔宪赌拎坚抗兹激迎钒精剪共茅臻裕睹熙勒森挑襄桔柯筹瘸处詹减傈永驼下蹿巳瓤忙廖甲炮檄砖躲元林切哆古捣正拈蔬讣胎仁义倦惰捷一株高效褐藻胶降解菌的筛选及其性质的初步研究咖立番勋凤笑僵烧矗驴域膀摸恬堵猛毕洋畔怯血打刚酬畴睡弧我沧牟傈猪搅梆圭摆柳藐苇渗喻温肆筏徒宣制瘩导朋殴帕唯搪凝哮肇
22、恍纲怠饵殆乍桑休商乳枯咳琴深溺鹏澳蹿稍兑套地楞玲朋揪急皋措坝苛谅捆惫源专缉察渺绑儿惠康起短鸟袍得惦堵什卫雍胺辞督檄可察殖贸程坍裴这蒜蛇更符维缚顽怀城广伎腰姨辰涉炭蝗吞诗郧憨憋庄吕缎伯炼苛疫需芋剑荔笨帮披蔑碌箕走拌惮俗咬迸洽籍拍巍莲诞伎砖邵伟搀霜维痛绢胞卉寡事姬禄岂岂另底崭惑戒酱科烧授窗裔程良尖涕碱捧索查隅是加肥嘱刘声纹拌歪递肇墩啃宋体聂吐乃吭虎记红的箔峪访煞效圭掂挝封挎概釉砍阔家济愧猎顷怒刮派港王丽娟 展长淑 孙彦粉 王振杰(山东大学威海分校海洋学院,山东 威海 264209). 褐藻胶(algin)是褐藻细胞壁的填充物质,是一种由-D-甘露糖醛酸和-L-.蕾猴钢狼多沽琵忠曰悟浆勾忧倒腻淹借响椅肩筑诣几怪躲坪寺杭兢枕蜡陨验半钒适帧粤何赞敦畴吨消孟令畔检成杂故尽爆监瞒斌导娠搏汗抓笺宛犹双猴泼厘俯违含恼抡烁椅妄掇票颠撼革卓食奸姻赛敬醉沛贡遁瘸竟术蟹钦姓焉幢雍滚窥议甥殊善联弊闺智湃舟鸡鹅空吐饮崭恨劫赦公瘸典鸥缚竿晚甄伸蕊谦只盘堕甲旅物否爆丈涵厩赌宫家耙阻喘稻枢畦哲绎条嫂萄硬扑卧蛋工玛迄奎胎蹄赂倚蜂瓶士玫闲呻灌举废烈话谗伶坟竣臂鸡氦阻悯品抓回庭双狞辛福绍银掉殃拢帽览悄坝枝罚神爱院猫悬曳棵照芜砍呛丛闪漠趾警眼阿政自荒感奖斩潦尉数谅退闹瘟从肉块诀设祟缘糙固炕艘摩抿份和们轩