引物设计原则必看.docx

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1、mi引物设计原则1. 引物的长度一般为15-30 bp,常用的是18-27 bp,但不应大丁 38,因为过长 会导致其延伸温度大丁 74C，不适丁 Taq DNA聚合酶进行反应。2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3'端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3'端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC,也会使 错误引发机率增加。3. 引物3'端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高丁其他3个碱基，因此应当避免在引物的3'端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构 也

2、可能导致PCR反应失败。5'端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰 位点或标记物。4. 引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利丁引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72C左右可使复性条件最佳。Tm值的计 算有多种方法，如按公式Tm = 4(G+C) + 2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻 近法(the nearest neighbor method)6. Am是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的 相对稳定性。应当选用3'端AG值较低(绝对值不超过9)，而5'端和中间A

3、G 值相对较高的引物。引物的3'端的AG值过高，容易在错配位点形成双链结构并 引发DNA聚合反应。7. 引物二聚体及发夹结构的能值过 高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚 体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR反应不能正常进行。8. 对引物的修饰一般是在5'端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入 PCR 产物的载体的相应序列而确定。引物序列应该都是写成5-3方向的，Tm之间的差异最好控制在1度之内，另外我觉得扩增长度大一些比较好,500bp左右。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是 否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，

4、 就要避开它。如这一段不能 形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。产物不能形成二级结构。 引物长度一般在1530碱基之间。G+C含量在40%60%之间。 碱基 要随机分布。引物自身不能有连续4个碱基的互补。引物之间不能有连 续4个碱基的互补。 引物5端可以修饰。 引物3端不可修饰。 引物 3端要避开密码子的第3位。1. 引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过 70%或有连续8个互 补碱基同源。2. 避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区 DNA二级结 构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。 用有关计算机软件可以预

5、测 估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择棋板。实验表明，待扩区域自由能( G° )小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用 7-deaza2-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。3. 长度 寡核苜酸引物长度为1530bp, 一股为2027mer。引物的有效长度：Ln=2 (G+C) + (A+T) , Ln值不能大于38,因为38时，最适延伸温度会超过 TaqDNA聚合酶的最适温度(74C)，不能保证产物的特异性。4. G+C含量G+C含量一般为40%60%。其Tm值是寡核苜酸的解链温度，即在 一定盐浓度条件下，50%寡核苜酸双链解链的温度

6、，有效启动温度，一般高于Tm值510C。若按公式Tm=4 (G+C) +2 (A+T)估计引物的Tm值，则有效 引物的Tm为5580C，其Tm值最好接近72 C以使复性条件最佳。5. 碱基础随机分布 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚喋吟或聚嚅 噬的存在。尤其3'端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集 序列区错误引发。6. 引物自身 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与棋板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于 3bp。7. 引物之间两引物之间不应不互补性，尤应避免 3端的互

7、补重叠以防引物二聚 体的形成。一对引物问不应多于 4个连续碱基的同源性或互补性。8. 引物的3端 引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰。3端也不能有形 成任何二级结构可能，除在特殊的 PCR （AS-PCR）反应中，引物3'端不能发生 错配。在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800 mol/L dNTP（四 种 dNTP 各 200 mol/D 以质粒（103 拷贝）为棋板，按 95C, 25s； 55C , 25s； 72C , 1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下，引物3端错配对扩增产 物的影响是有一定规律的。A : A错配使产量下降至1

8、/20, A : G和C ： C错七 下降至1/100。引物A :棋板G与引物G:棋板A错配对PCR影响是等同的。9. 引物的5端 引物的5'端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因 此，可以被修饰而不影响扩增的特异，性。引物 5'端修饰包括：加酶切位点；标记 生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；弓I入蛋白质结合DNA序列；弓I入突变位点、 插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。10.密码子的简并如扩增编码区域，引物3'端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影 响扩增特异性与效率。Hairpin发卡结构如果自由能值大于0则该结构不稳定从而

9、不会十扰反应如果自由能值小于0则该结构可以十扰反应二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向。引物之间形成如果配对区域在3末端问题会更为严重3末端配对很容易引起引物二聚 体扩增使Pair Rating匹配度评分匹配度低的引物对常常不太有效是因为在同样退火温度 下Tm低的引物决定扩增的特异性而 Tm高的引物更易于形成非特异性结合而造 成错误的起始11引物的长度以15 30bp为宜，否则会影响扩增的特异性。【2】碱基尽可能随机分布，避免相同的碱基成申排列，弓I物的 G+C含量在 40% 60%之间，若G+C含量太低，可在5'端加上一些G或C,若G+ C含量 太高，可在5'端加上一些A或

10、To【3】 应避免每条引物内部形成二级结构及两条引物的3'端互补形成引物二聚体，避免在引物的3'端有3个G或3个C成申排歹U, 3'端的末位碱基最好选T、 C、G,而不选A,也有建议在引物的两端用1 2个喋吟碱基。【4】 尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过5C）,退火温度 根据较低的Tm值选定，也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火温 度。Tm值可以根据Tm=4（G+C）+2（A+T）计算。而对于较长的引物，Tm值需要 考虑动力学参数、从 最近邻位”的计算方式得到，现有的PCR引物设计软件大 多数都采用这种方式。（注：对于Tm值的计算有争议的地方是附

11、加序列应不应 该计算在内，我觉得有值得商讨的地方。因为从理论上只有最开始的循环引物的 附加序列是不与棋板链结合的，而在后来的PCR反应中，引物的附加序列是和棋板链结合了的。）【5】引物的3'端要与棋板严格配对，而5'端碱基没有严格的限制，只要与模 板DNA结合的部分足够长，其5'端碱基可不与棋板DNA配对而呈游离状态， 这样，我们可以在引物的5末端加上酶切位点（引入酶切位点时，要考虑到进行 双酶切的共用缓冲液，否则给下游工作带来困难）、启动子，方便下游操作。【6】不要在扩增序列的二级结构区设计引物， 以免退火困难。也要考虑引物设 计处棋板的特异性。PCR引物设计的目的是

12、为了找到一对合适的核苜酸片段，使其能有效地扩增模 板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到 PCR的特异性与成功与否。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是 否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构， 就要避开它。如这一段不能 形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为1530碱基，扩增片段长度为100600碱基对。让我们先看看P1引物。一般引物序列中 G C含量一般为40%60%。而且四种 碱基的分布最好随机。不要有聚喋吟或聚嚅噬存在。否则 P1引物设计的就不合 理。应重新寻找区域设计引物。同时引物之间也

13、不能有互补性，一般一对引物问不应多于4个连续碱基的互补。引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5端加酶切位点 序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3'端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3端开始的。这里还需提醒的是 3'端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特 异性与效率。综上所述我们可以归纳十条 PCR引物的设计原则： 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 产物不能形成二级结构。 引物长度一般在1530碱基之间o G C含量在40%60%之间。 碱基要随机分布。 引物自身不能有连续4个碱基

14、的互补。 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物5'端可以修饰。 引物3'端不可修饰。 引物3'端要避开密码子的第3位。PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苜酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到 PCR的特异性与成功与否。对引物 的设计不可能有一种包罗万象的规则确保 PCR的成功，但遵循某些原则，则有 助于引物的设计。1. 引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过 70%或有连续8个互补碱基同源。2. 避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区 DNA二级结构的影响，选择扩增片段时 最好避开二级结构区域。用有关计算

15、机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择棋板。实验表明，待扩区域自由能( G° )小于58.6lkJ/mol时， 扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用 7-deaza2'-脱氧GTP取代dGTP 对扩增的成功是有帮助的。3. 长度寡核苜酸引物长度为1530bp, 一股为2027mer。引物的有效长度：Ln=2 (G C) (A T , Ln值不能大于38,因为38时，最适延伸温度会超过 Taq DNA聚合酶 的最适温度(74C)，不能保证产物的特异性。4.G C含量G C含量一般为40%60%。其Tm值是寡核苜酸的解链温度，即在一定盐浓度 条件下，50%寡核

16、苜酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值510 Co 若按公式Tm=4( G C) 2( A T)估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为5580C , 其Tm值最好接近72 C以使复性条件最佳。5. 碱基础随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚喋吟或聚嚅噬的存在。尤其 3' 端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G C富集序列区错误引发。6. 引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复 性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与棋板的复性结合。若用人工判断， 引物自身连续互补碱基不能大于 3bp。7. 引物之间两引物之间不应不互补

17、性，尤应避免3'端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一 对引物问不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。8. 引物的3端引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。3端也不能有形成任何二级结 构可能，除在特殊的PCR （AS-PCR）反应中，引物3'端不能发生错配。在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800 mol/L dNTP（四种dNTP 各 200 mol/D 以质粒（103 拷贝）为棋板，按 95C, 25s； 55C , 25s； 72 C, 1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下，引物3端错配对扩增产物的影 响是有一定规律的。

18、A : A错配使产量下降至1/20, A : G和C ： C错七下降至 1/100。引物A:棋板G与引物G:棋板A错配对PCR影响是等同的。9. 引物的5端引物的5'端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被 修饰而不影响扩增的特异性。引物 5'端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧 光、地高辛、Eu3等；引入蛋白质结合DNA序列；弓I入突变位点、插入与缺失 突变序列和引入一启动子序列等。10. 密码子的简并如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发 生简并，会影响扩增特异性与效率。特殊目的的引物设计将在有关章节讨论。随着人们对引物的认识，一些引物的计算机设计程序也应运而生，下面将讨论有关引物计算机设计方法。