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1、SDS-PAGE 电泳试剂 1) 30%储备胶溶液： 丙烯酰胺( Acr)29.0g ，亚甲基双丙烯酰( Bis ) 1.0g ， 混匀后加 ddH2O，37OC 溶解,定容至 100 mL, 棕色瓶存于 4OC； 2) 1.5M Tris-HCI(pH 8.8) : Tris 18.17g 加 ddH20 溶解，浓盐酸调 pH 至 8.0, 定容至 100mL ； 3) 1M Tris-HCI(pH 6.8) : Tris 12.11g 加 ddHzO 溶解，浓盐酸调 pH 至 6.8,定容 至 100 mL ； 4) 4 分离胶缓冲液 ： 0.4gSDS 溶于 1.5M Tris-HCI(
2、pH 8.8) ，定容至 100mL； 5) 4 浓缩胶缓冲液 ： 0.4gSDS 溶于 1M Tris-HCI(pH 6.8) ，定容至 100mL； 6) 10 电泳缓冲液 (pH 8.3) ：Tris 3.029g ，甘氨酸 14.415g ，SDS 1g 加 ddH2O 溶解,定容至 100mL ； 7) 10% 过硫酸铵(Aps,现配)：1g AP 力口 ddH2O 至 10mL ； 8) 2 SDS 电泳上样缓冲液： 1M Tris-HCI(pH 6.8)2.5mL ， -巯基乙醇 1.0mL， SDS 0.6g ，甘油 2.0 mL ，0.1%溴酚兰 1.0 mL，ddH2O 3
3、.5mL ； 9) 考马斯亮兰染色液： 考马斯亮兰 R2501.25g ,甲醇 225 mL ,冰醋酸 50 mL , ddH2O 225mL ； 10) 脱色液：甲醇、冰醋酸、ddH2O 以 2 ：配制而成； 11) 分离胶(12.5%) : ddH2O 4mL， 30%储备胶 5 mL， 4 分离胶缓冲液 3mL, 10% Aps 0.1mL(现配),TEMED(N,N,N :N 四甲基乙二胺)10 此； 12) 浓缩胶( 5)： ddH2O 2.65mL ， 30%储备胶 0.85mL， 4 浓缩胶缓冲液 1.25mL , 10%Aps 50 让,TEMED 5 此。 Tricine (
4、三羟甲基氨基甘氨酸) - SDS - PAGE 蛋白质电泳 1 Tricine - SDS - PAGE 蛋白质电泳溶液准备 1) 正极缓冲液(10 为:14g Tris 溶于 400mL 重蒸水,用 1. 0M HCl 调至 pH8. 9 , 定容至 500mL 。 2) 负极缓冲液(10 X):将 60. 55g Tris ,89. 58g Tricine 及 5g SDS 溶于 400ml 重蒸水中 ,加水至终体积为 500mL。 3) 凝胶缓冲液(3 X :将 181. 5g Tris ,1. 5g SDS 溶于 400mL 重蒸水中，用 1MHCl 滴定至 pH8. 45 , 再加水
5、稀释至 500mL 。 2 丙烯酰胺储存液配制 1) 3C- 丙烯酰胺储存液 (3C-stock) 将 48g 丙烯酰胺和 1. 5g 甲叉双丙烯酰胺溶于重蒸水中配成 100mL 49. 5 %的 储存液。 2) 5C- 丙烯酰胺储存液 (5C-stock) 用重蒸水溶解 47g 丙烯酰胺和 2. 5g 甲叉双丙烯酰胺成 100mL 49. 5 % 的储存 液。 3 Tricine-SDS-PA GE 的凝胶制作 1) 小孔胶 3mL : 1mL 凝胶缓冲液 (3x) 、0 . 4 g 甘油、 1 mL“6 C 凝胶储存液”、 用去离子水稀释至 3 mL ,临用时加入 10 u L 的 10%
6、过硫酸氨溶液和 1 u L 的 TEMED 。 2) 夹层胶 3 mL: 1 mL 凝胶缓冲液(3x)、0. 61 mL 3C 凝胶储存液”，用去离子水 稀释至 3 mL,临用时加入 10 u L 的 10% 过硫酸氨溶液和 1 u L 的 TEMED。 3) 浓缩胶 2 mL : 0. 5 mL 凝胶缓冲液 (3x)、 0. 16 mL “3C 凝胶储存液” , 用去离 子水稀释至 2 mL , 临用时加入 10 u L 的 10% 过硫酸氨溶液和 1 u L 的 TEMED 。 用垂直小电泳槽制胶电泳。先铺小孔胶 , 接着均匀注入夹层胶 , 凝胶聚合后 再铺浓缩胶。 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
7、 (SDSPAGE) 分析 1 )准备： 电泳玻璃板用双蒸水洗净，戴上手套再用无水乙醇擦拭玻璃板、梳子等并晾干， 按说明安装好电泳装置。 2) 12.5% 分离胶灌制 取一洁净的 20mL 烧杯，分别加入： ddH2O 4mL 30%储备胶 5mL 4 分离胶缓冲液 3mL 10% Aps（ 现配 ） 0.1mL 100%TEMED 0.01mL 轻轻旋转混匀溶液，用 5mL 移液器灌入玻璃板间，以水封顶，使液面平整。 3) 5浓缩胶灌制 取一洁净的 20mL 烧杯，分别加入： ddH2O 2.65mL 30%储备胶 0.85mL 4 浓缩胶缓冲液 1.25mL 10% Aps 50 L 10
8、0%TEMED 5 口 L 待分离胶凝聚后，再配制 5% 的积层胶，将分离胶上的水倒去，灌入积层胶，立 即将梳子插入玻璃板间，待积层胶聚合后，拔出梳子，用蒸馏水洗尽凝胶顶部。 4) 上样与电泳 将凝胶玻板置于电泳槽中，加入事先准备好的电泳缓冲液，加样完毕后，使样 品端与阴极连通，另一端与阳极相连，根据本试验蛋白质大小等各项特性，分 离胶选用 120V 固定直流电压，积层胶选用 60V 固定直流电压，当样品中溴芬兰 色带快接近凝胶顶部时结束电泳，约 3 小时。 5）染色及脱色 电泳结束后， 用考马斯亮蓝染液浸泡， 放摇床上室温缓慢旋转 2 小时，回收染液， 用脱色液浸泡凝胶，放摇床上室温缓慢摇动脱色，每两小时换一次脱色液，直 至脱色完全后用数码像机拍照保存。