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1、.Gen. Microbiol. Lab., 2008Dept. Agri. Chem., NTU實驗十二 水的標準定性分析及選擇性培養基 Exp. 32. Standard Qualitative Analysis of Water一、目的：1. 判定水質樣本中是否有大腸桿菌群 (coliform bacteri) 的存在。2. 獲得在樣本中出現微生物之最確數指標 (the most probable number index, MPN index)。3. 確定在推斷試驗 (presumptive test) 出現陽性反應的試管中，確有大腸桿菌群(coliform bacteria) 的存在
2、。4. 確認水樣中的大腸桿菌群 (coliform bacteria)。二、原理：水質分析方法如最確數法 (The most probable number method, MPN method)及濾膜過濾法 (The membrane filter method) 均常被用來做例行的水質檢驗，以確保飲用水之安全。本實驗使用最確數法，又稱為多管測試法 (The multiple tube method)， 因為大腸桿菌群 (coliform bacteria)可以醱酵乳糖，同時產生酸及氣體(CO2)，故可使用乳糖醱酵培養基 (lactose fermentation broth; LB) 來測
3、試，並在試管中倒置一小管 (Durham tube)，以收集放出的氣體。除了乳糖，培養基中並含有膽鹽(bile salt)，以抑制 coliform bacteria 以外之其他微生物生長。最確數法分為三個測試階段，即推斷試驗 (Presumptive test)、確認試驗 (Confirmed test) 及完成試驗 (Completed test) 【參考課本 p. 180-183】。對於每一水樣的測試至少使用 6 支試管 (使用愈多試管，其敏感度愈高)，分成三組：LB2×- 10 ml、LB1×- 1 ml 及 LB1×- 0.1 ml 各三支，測試時在每支
4、試管中，加入與培養基等量的水樣。培養過後，若有氣體出現，則可作為 coliform bacteria 存在的假設性證據 (presumptive evidence)，並以其出現產氣反應的試管數目，作為微生物數目的指標，對照課本Table VI, Appendix A，即可得到 ”最可能數值指數” (most probable number test index; MPN index)。由於在推斷試驗(Presumptive test)中出現的陽性反應，也可能是 noncoliform 微生物所造成，故須將出現陽性反應試管中的微生物取出，作進一步鑑定。所以在確認試驗 (Confirmed tes
5、t) 中，使用 eosin-methylene blue (EMB) agar (伊紅甲烯藍瓊脂) 或 endo agar 作為選擇及鑑別培養基：i. 在 EMB agar 中，其 methylele blue 成分可抑制格蘭氏陽性菌的生長。培養後其上之菌落顏色，可區分以下三群：a. Escherichia coli 之菌落具有金屬光澤且中央呈黑色。b. Aerobacter aerogenes 之菌落中心呈棕色。c. 非乳糖醱酵菌呈粉紅色。ii. endo agar 中含有無色態的 fuchsin (複紅)，當 coliform bacteria 在其上生長，並產生酸性產物時，會與 fush
6、in 反應生成深粉紅色錯合物，因而在其菌落及周圍培養基上呈現出此色來。最後的完成試驗(completed test) 則是將在確認試驗 (confirmed test) 中所確認的 coliform colonies，取出接種至 lactose fermentation broth 及 NA slant 中。在 lactose fermentation broth 中可觀察到產氣情形；而在 slant 培養後長出來的菌落，取出作 Gram stain，應可觀察到格蘭氏陰性桿菌，即進一步確定其為 E. coli。三、器材： A：1. culture：池水或飲水機的水 50 ml滅菌牛奶瓶 1 個
7、2. medium：Lactose Broth 2×(LB2×) 3 支Lactose Broth 1×(LB1×) 6 支3. equipment：pipette aid 1 支10 ml pipette 1 支1 ml pipette 1 支 (吸 1，0.1 ml)B：1. culture：24 hr LB(+)2. medium：EMB plate 1 個Endo plate 1 個C：1. culture：24 hr EMB or Endo plate(+)2. medium：NA slant 1 支Lactose broth 1 支四、實驗步
8、驟【參考課本 Figure. 48.1, p. 181】A. 取樣 (Sampling)：1. 牛奶瓶口用 70% alcohol 擦拭一下，取池水或飲水機冷水約 50 ml (白線下 2/3 強)，瓶口不要碰到飲水機出水口。B. 推斷試驗 (Presumptive test)： 1. 取池水或飲水機水各 10 ml 加入 LB2× 中（有 3 支）1.0 ml加入 LB1× 中（有 3 支）0.1 ml加入 LB1× 中（有 3 支） 2. 35，培養 24 hr。3. 觀察記錄 LB 是否有氣泡產生1。4. 35，培養 48 hr (繼續培養一天)。5. 觀察
9、記錄 LB 是否有氣泡產生1。6. 對照查表 Table VI, Appendix A，算出 MPN。1 判斷與記錄方式：a. 陽性反應 (positive)：24 hr 後，產生氣體的量³ 10% 體積b. 疑似陽性反應 (doubtful)：48 hr 後才有氣體產生c. 陰性反應 (negative)：48 hr 後仍無氣體產生C. 確認試驗 (Confirmed test)：1. 以接種環取 LB (+) (即產氣反應為陽性者) 菌液，以四區劃線法畫線於 EMB 及 Endo plate 中。2. 35，培養 24 hr。 若第二天觀察皆無 LB(+) 者，則以助教所給之 M
10、ix culture (P. aeruginosa + E. coli) 當作 B 之 culture，繼續做下去。D. 完成試驗 (Completed test)：1. 取 EMB plate (+) (即黑心綠色金屬光澤菌落 E. coli)或 Endo plate (+) (即粉紅實心菌落 coliform）接種入 LB 及 NA slant 中。2. 35，培養 24 hr。3. 觀察是否 LB (+)。4. 做 Gram Stain，確認該菌是否為 G (-)。 Exp. 33. Use of Differential and Selective Medium一、目的：熟悉作為鑑別與
11、選擇微生物時之特殊培養基，並瞭解其功能。二、原理：有許多特殊目的之培養基可供選擇，以達下列功能：1. 自混合的族群中分離出不同型的細菌。2. 鑑別在巨觀的菌落形態及生化反應特徵上密切相關之細菌族群。3. 列舉說明在公共衛生微生物學範圍的細菌。4. 對自然發生物 (如抗生素、維他命及工業發酵的產物) 之化驗。5. 利用在不同培養基中產生化學變化之能力，來鑑別及定性各種細菌。可分以下兩類型之培養基：A. 選擇培養基 (selective media)：用以選擇 (分離) 特殊的細菌族群；該類培養基因含有某種化學物質可以抑制某型細菌生長，而允許另一型生長，故可促進特定細菌的分離。B. 鑑別培養基 (
12、differential media)：所含成分可鑑別形態及生化上相關的族群。其中的化學物質在接種培養後，可使不同種類的細菌本身或其周圍培養基的外觀產生不同改變，而可鑑別之。以下各種培養基為代表：1. 甘露醇鹽類瓊脂 (mannitol salt agar)：含有高濃度鹽類 (7.5% NaCl)，可抑制多數細菌的生長，但葡萄球菌 (staphylococci) 例外。有些葡萄球菌可發酵其中所含的甘露醇而產生酸，使培養基中的酚紅變色，在其生長的周圍產生黃色帶，而不能利用甘露醇的葡萄球菌則否。2. 血液瓊脂 (blood agar)：在培養基中另入血液作為營養成分以培養苛求菌如鏈球菌屬 (Str
13、eptococcus)；其溶血特性可分類如下：a. g 型溶血：紅血球不溶解，在菌落周圍的培養基無明顯外觀上的改變。b. a 型溶血：紅血球不完全溶解，隨著氧化血紅素 (methemoglobin) 的產生，在細菌菌落周圍產生一道淺綠色的暈輪。c. b 型溶血：紅血球完全被溶解，在菌落周圍產生一道明淨帶。此溶血現象是由兩種溶血素造成：忌氧鏈球菌溶血素 (streptolysin O)具抗原性，對氧不穩定；耐氧鏈球菌溶血素 (streptolysin S)無抗原性，對氧穩定。以戳入接種時，可在較無氧的環境中，提高忌氧鏈球菌溶血素的作用，而增強溶血反應。3. 馬康基氏瓊脂 (MacConkey a
14、gar)：其中所含的結晶紫會抑制格蘭氏陽性菌的生長，而可分離出格蘭氏陰性菌。其中所含的乳糖、膽鹽及中性紅，則可因對乳糖的發酵能力不同，而將腸菌 (enteric bacteria) 區分成兩群：a. coliform bacilli：可發酵乳糖而產生酸，繼而使膽鹽沈澱，為中性紅所吸收而呈紅色。E. coli 為此群中能產生最大量之酸者。b. dysentery、typhoid 及 paratyphoid bacilli：不能發酵乳糖亦不產生酸及如上的反應。其菌落無色且常透明。4. 伊紅甲烯藍瓊脂 (eosin-methylene blue agar)：在 coliform bacilli 中，
15、E. coli 的菌落因為產生大量的酸，而呈藍黑色並有綠色金屬光澤；而其他 coliform bacilli 的細菌菌落，如 Enterobacter aerogenes 則呈粉紅色、薄的黏液狀。不能利用乳糖的其他細菌則為透明，因培養基原色而呈紫色。此培養基亦對格蘭氏陽性菌有部分抑制性。5. 苯乙醇瓊脂 (phenylethyl alcohol agar)：用以分離大部分格蘭氏陽性球菌，對格蘭氏陰性菌有抑制性，在其上所形成的菌落均比在其他培養基上的來得少且小。三、器材：1. culture：Enterobacter aerogenes（縮寫代號為 En.）Escherichia coli（E.
16、）Streptococcus var.Lancefield Group E （Gr.E.）Streptococcus mitis（Str.）Staphylococcus aureus（Sta.）2. medium：Mannitol salt agar plate，Blood agar plate，Phenylethyl alcohol agar plate，EMB agar plate，MacConkeys agar plate四、實驗步驟1. 了解菌株在選擇與鑑別培養基上的特性。a. 將 Mannitol salt agar plate 劃分成 3 區域，畫直線接種入 Sta.，Gr.E. 及 E.。b. 將 Blood agar plate劃分成 2 區域，以四分畫線法接種入 Str. 及 Gr.E.。c. 將 Phenylethyl alcohol agar 劃分成 2 區域，以四分畫線法接種入 Sta. 及 E.。d. 將 EMB agar plate 劃分成 3 區域，以四分畫線法接種入 Sta.，En. 及 E.。e. 將 MacConkey agar 劃分成 3 區域，以四分畫線法接種入 Sta.，En. 及 E.。2. 將 a-e 放入 35 培養箱中，24 hr 後觀察。 *;73