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1、大肠杆菌抗药性菌株的筛选【实验目的】掌握微生物变异的原理，学习用梯度平板法分离抗药性突变株。【实验原理】基因突变可分为自发突变和诱发突变。许多物理、化学、生物因 素对微生物都有诱变作用。基因中碱基顺序的改变可导致微生物细胞的遗传变异。这种变异有时能使细胞在有害的环境中存活下来，抗药性突变就是一个例 子。抗药性突变株是指野生型菌株基因突变产生的对某些化学药 物的抗性变异类型，可在加有相应药物的培养基平板上选出。抗药性突变是DNA分子的某一特定位置的结构改变所致，有药物的存在无关，药物的存在只是作为分离某种抗药性菌株的鉴别手 段。在含有一定浓度抑制生长的药物平板上涂布大量的细胞群 体，极个别抗性突
2、变的细胞在平板上长成菌落。纯化后进一步进行抗性试验，就可以得到所需的抗药性菌株。为了便于选择适当的药物浓度， 分离抗药性突变株常用梯度平板 法。本实验用梯度平板法分离大肠杆菌抗链霉素、青霉素和红霉素突变株。【实验器材】大肠杆菌；LB液体培养基；LB琼脂培养基；链霉素、青霉素和红霉素；70%乙醇；无菌吸管，烧杯，试管，玻璃涂棒，水 浴锅等。【操作步骤】1接种大肠杆菌与盛有5ml L B培养液的试管中，37 C震荡培养 24h。2. 在水浴锅中融化LB培养基。3. 倒10ml已融化不含药物的LB琼脂培养基于无菌培养皿中， 将培养皿一端垫起使培养皿表面在垫起的一端刚到培养皿的底 与边的交界处凝固。4
3、. 在凝固的平板底部高琼脂一边标上低，放平后在底层培养基上分别加入每毫升含有100ug链霉素、青霉素和红霉素的LB琼脂 培养基10ml，凝固后制得链霉素浓度从 0到另一端的i00ug mi 的梯度平板。5. 用1ml无菌吸管吸取0.2ml大肠杆菌培养液加到梯度平板上。用无菌玻璃涂棒将菌液均匀涂布到整个平板表面。如用蘸有乙醇并经火焰灭菌的玻璃涂棒，可在火焰旁或伸进培养皿在板盖上充 分冷却以免烫死细胞。6. 将平板于37 C培养48 h.7. 选择1 2个生长在梯度平板中部的单个菌落，用无菌接种环 接触该菌落朝高药物浓度的方向划线。8. 将平板倒置于37 C培养48 h。【注意事项】1. 玻璃涂布棒在火焰上灼烧后要待其冷却后再进行涂布，以免烫死细胞；可以蘸上乙醇后在火焰上灼烧，以缩短冷却的时间。2. 制备含药平板时，务必使药物与培养基充分混匀。3. 严格无菌操作，勿将杂菌误为抗药性大肠杆菌。注：LB(Luria-Bertani)培养基蛋白胨10克酵母膏5克NaCI10克蒸馏水1000mlPH7.0121 C灭菌 20min.