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1、.化妆品防腐效能评价方法的现状与发展趋势 摘要：建立良好的防腐体系，保证产品的微生物安全性，对于化妆品的品质十分重要。因为防腐体系的防腐效能与多种独立因素有关，所以防腐体系的防腐效能检测需要一套可靠的评价方法。本文阐述了防腐效能评估方法的现状与发展趋势，着重介绍了防腐挑战试验方法。CTFA推荐的防腐单次挑战试验是其中被公认的较经典的方法，而且在化妆品行业被广泛使用。关键词：化妆品、防腐体系、防腐挑战试验 引言 随着市场竞争的日益激烈，消费者对产品质量的要求越来越高，对于化妆品来说，保证其微生物安全性是保证其品质的一个重要方面。微生物是生物界中一群体形微小，结构简单的低等生物，包括属于原核类的细
2、菌、放线菌、支原体、立克次氏体、衣原体和蓝细菌，属于真核类的真菌(酵母菌和霉菌)、原生动物和显微藻类，以及属于非细胞的病毒、类病毒和朊病毒等。在种类繁多的微生物中，与化妆品有关的主要有病源性细菌和致病真菌。病源性细菌按革兰氏染色反应的不同，分为G+和G-菌，G+菌主要有金色葡萄球菌、链球菌、双球菌等，G-菌主要有绿脓杆菌、粪大肠杆菌群、沙门氏菌等。致病真菌大致可分为霉菌、酵母菌，这些真菌除致病反应外，其代谢产物可能引起皮肤过敏反应【1】。为保护消费者的利益，国标中对化妆品的微生物学质量做出了明确规定【2】： I眼部、口唇等粘膜用化妆品细菌总数不得大于500CFUg或500CFUg。 II其他化
3、妆品细菌总数不得大于1000CFUg或1000CFUg。 III每克或每毫升产品中不得检出粪大肠菌群、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌。 化妆品中霉菌和酵母菌总数不得大于100CFUg或100CFUg。实际上化妆品生产企业的内控标准往往较国标严格。由于大多数化妆品富含微生物生长所需的养分，如果产品中没有建立合理的防腐体系，环境中的微生物一旦大量侵入，即可迅速繁殖，破坏产品的品质，损害消费者的健康。所以建立良好的防腐体系，保证产品的微生物安全性，对于化妆品的品质十分重要【3】。化妆品的防腐体系往往是由多种防腐剂按一定比例构建而成的。防腐体系的效能与多种因素有关，如：(1) 配方的剂型 (液体、粉体、乳剂
4、、膏霜等)；(2)配方中可被微生物利用的营养物的含量(蛋白、碳水化合物、动植物提取物等)；(3)pH值、温度、湿度等；(4)可能污染的微生物的种类和数量等【4】。防腐体系的效能与多种独立因素密切相关，因此我们很难直接从配方中所用的防腐剂的种类和用量简单地推导出该配方的防腐效能。因此建立符合实际情况的、可操作性强的防腐效能测试方法和评估标准对于防腐体系的构建与筛选十分重要。 1防腐效能评价方法的现状 评判一种防腐剂抑菌作用的最简单的方法是抑菌圈试验【5】：细菌或霉菌在适合的培养基上，经培养后能旺盛生长，若培养基平板中央放有经防腐剂处理的滤纸圆片，防腐剂向四周渗透，可形成抑菌圈。量出抑菌圈直径的大
5、小，可以判断出防腐剂的效力。 MIC试验同样可以反映防腐剂的效力。MIC即测定防腐剂抑制微生物生长的最低浓度。MIC值越小，表明防腐剂抑菌能力越大【6】。 在通过抑菌圈试验、MIC试验初步反映防腐效果后，需要进一步评价防腐体系在以水或油为主要基质的产品中的防腐效能和时效性，可通过防腐挑战试验来完成r刀。防腐挑战试验可以模拟化妆品在消费者重复使用过程中受到的高强度微生物污染的潜在可能性、微生物生长的最适条件，反映产品抗微生物污染的能力。由于防腐挑战试验可在较短时间周期内完成，仅需少量样品，可使用相当多种类的微生物进行测试，而且可同步评估多种样品。该方法的以上优点使得它在近年来被越来越多的中外化妆
6、品企业所接受和推行。由于防腐挑战试验是经验性的方法，目前世界各国以及相关组织对化妆品防腐挑战实验还没有统一的规定，但各种不同的防腐挑战试验基本原理都是相通的【8】。化妆品防腐挑战试验较具代表性的三个方法来源是：化妆品和香料香精协会(me Cosmetic，Toiletry and Fragrance Association，CTFA)、美国材料实验协会(the American Society for Testing and Materials,ASTM)、美国药典(USPharmacopeia,USP)【9】。 11 CTFA推荐的防腐单次挑战试验 目前较为常用的是CTFA推荐的经典的为期2
7、8天的防腐单次挑战试验。该方法是将防腐剂混入配方基质中，然后一次性接入若干种类、一定数量的微生物进行挑战，将样品存放于适当的温度下，定期抽样检测其中残余的微生物，并根据微生物的数量变化情况评价样品的抗菌效果。该方法的要领在于： ·挑战用菌的选择 ·待测样品的准备 ·接种的方式和数量·分离检测的时间 111挑战用菌的选择CTFA微生物方法指导(M-3，M-4)【10】【11】推荐的挑战用菌：种类菌株数量革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌 StaAureus至少选一种表皮葡萄球菌 StaEpidermidis发酵革兰氏阴性杆菌肺炎克雷伯氏菌 Klepneumonia
8、e至少选二种阴沟肠杆菌 Entcloacae大肠希埃氏菌 EseColi日勾维肠杆菌 Entgergoviae变形菌属 Proteus sp绿脓杆菌 PseAeruginosa洋葱假单胞菌 Psecepacia非发酵革兰氏阴性杆菌荧光假单胞菌 Psefluorescens至少选一种恶臭假单胞菌 Pseputida黄杆菌属 Flavobatcterium sp不动杆菌属 Acinetobacter sp酵母白色假丝酵母 Candida albicans至少选一种近平滑假丝酵母 Candida parapsilosis霉菌黑曲霉 Aspergillus niger至少选一种黄绿青霉 Penicil
9、liurn luteumCTFA还推荐Inhouse菌株，即从污染产品中分离到由环境或使用引入的菌株。因为这更接近与生产环境的状况，使产品抗微生物的能力更切合实际的考验。对于一个质量要求严格的企业来说，分别用标准菌株和In。house分离菌株同时进行挑战是一个最理想的选择，因为使用标准菌株可以防止“漏掉”该产品“刚好”没有污染到的微生物。而使用Inhouse分离菌株，又能加强可能污染到的实际环境的微生物，从而使选择到的化妆品体系更具有可靠性。112待测样品的准备待测样品需预先做微生物总数检测，防腐挑战用样品必须是无菌的【4】。样品可按至少20克瓶分装，匝保证样品数量充足【4】。113接种的方式
10、和数量接种方式可以采用单菌接种或混合接种。单菌接种工作量大、费时，但是有助于研究各特定挑战用菌株的单独数据；混合接种工作量相对较小，而且因为自然界的微生物有混生杂居的特点，所以混合接种符合实际污染情况。 CTFA推荐的接种数量为：混合细菌I×106CFUg或CFUml混合霉菌1×104CFUg或CFUml(ASTM推荐1×105CFUg或CFUm1)混合酵母菌1×104CFUg或CFUml(ASTM推荐1×105CFUg或CFUm1) 接种后样品需搅拌均匀。114分离检测的时间接种后的样品在特定时间分离检测：0小时(即接种后立刻取样)、1天、3
11、天、7天、14天、21天和28天【4】。药品12防腐体系的效能评价标准CTFA的评价标准混合细菌、混合霉菌和混合酵母菌的接种量分别为1×106CFUg(CFUm1)、l×104CFUg(CFUm1)和1×104CFUg(CFUm1)，要求在第7天时，细菌降低999，霉菌和酵母菌各降低90，并且在28天内持续下降。美国在CTFA评价方法的基础上提出更为严格的标准【12】：如果单菌接种的三个平行试验中任何一个微生物数量的平均值，在第7天时下降到100CFUg(CFUm1)以下，在28天内全部降至0CFUg（CFUm1)，那么视为防腐效果优秀，通过挑战试验；如果在第7天
12、时下降到1000CFUg(CFUml )下，那么视为勉强通过；如果单菌接种的任何一种微生物，任何一个平行样达不到上述标准，也达不到CTFA的标准，那么该防腐体系不能通过防腐挑战试验。一般来说，在没有特殊要求的情况下，通过单次挑战即可应付二次污染。2防腐效能评价方法的发展趋势为了模拟化妆品使用过程中受到更高强度的微生物污染的潜在可能性和自然界中微生物生长的最适条件，使得测试结果更接近残酷的现实，能经受严峻的考验，防腐剂重复挑战实验应运而至。不同防腐剂重复挑战方法的不同之处主要体现在接种、抽样的时间和次数：A每两天接种一次，每次接种前抽样检测，共连续接种6次，为期两周，若系统崩溃则可提前终止接种。
13、B在试验开始时接种一次，第1、2、7、14天抽样检测，若系统未崩溃，第21天再次接种，此后定期抽样检测，试验周期共28天。C每隔二周接种一次，连续三次(即第1、3、5周接菌)，每二周接菌前抽样检测一次，试验周期49天。D每周接种一次，连续5次，每次接菌前检测一次，试验周期35天。据Schulke&Mayr公司的资料介绍【13】，采用D法评价认可的防腐体系可保证产品在30个月内的微生物安全性。但该方法试验周期过长，可操作性不强。显然重复挑战较之单次挑战更为严格，但是这种方法也不是完美无缺。由于连续接种会造成样品被稀释，影响防腐体系的效果，使实验结果出现误差。因此有人提出了防腐剂梯度挑战法
14、，即将105109CFUg浓度梯度的菌液接种于同一组样品中进行挑战，取样时间和方法同单次挑战，所测试的防腐体系能通过的最高菌浓度，即体现了该体系的防腐效能。值得一提的是，产品的防腐效能，往往是产品在不同的特定条件(如pH、温度、湿度)下，所反映的抗微生物污染能力。考虑到这些不同的因素，重复挑战试验可以进一步演化发展。例如：若pH可以显著地影响某产品的防腐效能，则可以在做重复防腐挑战试验的时候，设计一组不同pH梯度的样品进行测试【9】。此外，为了顺应生产上灵活快速的发展要求，一些快速检测方法迅速发展起来，如：ATP法、电阻法等【8】。但是因为种种原因并未广泛使用，主要是：方法本身不稳定；成本太高
15、。当然，因为防腐效能评价的方法和标准是经验性总结，所以评价方法和标准应该结合各个不同化妆品生产商的不同类型产品的实际情况而定。可通过样品保存试验、抗二次污染试验跟踪调查，检验化妆品防腐效能评价结论与实际存放效果的相关性。具体方法是：样品保存试验：取经防腐挑战试验评定为通过或有条件通过的样品在室温下存放312个月，检测样品的微生物总数指标【14】。抗二次污染试验：将能通过挑战实验的样品瓶盖打开，室温(2530)下暴露于普通室内48h，盖上瓶盖，在培养箱(28±2)培养5天，检测样品的微生物总数指标【14】。3结论：多年来各国的微生物学家一直致力于寻找更加可靠、易行、快速的防腐效能评估方法。防腐挑战试验是其中被公认的较经典的方法，而且在化妆品和医药行业被广泛使用。但是作为一种建立在经验基础上的方法，防腐剂挑战试验在国际上并没有统一的评价标准。找到实验数据与实际情况的关联，从企业的现状建立评价标准，不失为一种很好的选择。最后需要指出的是，如果某配方经过防腐剂挑战试验检测后，发现其防腐效能不理想，那并不是说该配方不能投入生产。在原料、生产环境、操作者的卫生条件严格控制，而且外包装设计可防止二次污染的情况下，该配方是可以投入生产的。;