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1、实验八 乳酸脱氢酶（LDH同工酶的琼脂糖凝胶电泳、实验目的了解琼脂糖凝胶电泳的方法和原理，学会分离 LDH同工酶的方法。、原理同工酶是指能够催化相同的化学反应，但酶分子的结构理化特性乃至免疫学 性质不同的一组酶，同工酶这种差异是由于酶蛋白的编码基因不同或基因相同但 转录、翻译或后加工有别所造成的。同工酶存在于生物的同一种属或同一个体的 不同组织，甚至同一组织或细胞的不同亚细胞结构中。人们已发现几百种同工酶。乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenaseLDH ）是人 们认识的第一个同工酶。LDH是糖酉解中的一个酶，它催化的反应如下。COOHCOOHI+ 一 、 IHOC H+NAD -
2、：'C= O+ NADH + H+CH3CH3LDH有五种同工酶，分子量在13万15万之间，由四个亚基组成。LDH的 亚基有两种类型，一种是心肌型亚基（H型）（B基因），另一种是骨骼肌型亚基 （M型）（A基因）。两类亚基以不同比例可组成五种四聚体。即LDH 1（H4）、LDH2（H3M1）、LDH3（H2M2）、LDH4（H1M3）、LDH5（M4）。H 型亚基与 M 型亚基的 氨基酸组成有差异，前者含酸性氨基酸残基多，故LDH可用电泳的方法进行分离。本实验用pH8.6的缓冲液，在此条件下电泳，LDH的五种同工酶均净带负 电荷，向正极泳动，但LDH 1最快，依次减慢，LDH5最慢。在哺
3、乳动物体内，一般厌氧性组织中，如骨骼肌、肝脏中，LDH5含量高；在非厌氧性组织中，如心、脑中，LDH 1含量高。本实验用琼脂糖凝胶，LDH的五种同工酶在琼脂糖凝胶板上分离后，进行酶 促反应，使乳酸脱氢生成NADH，NADH将人工递氢体PMS还原，还原型PMS 最终将NBT还原。+ + + NADH +H +PMS=NAD +PMSH2PMSH2+ NBT=PMS + NBTH2NBTH2为蓝色化合物。三、实验器材（一）、仪器1、电泳仪1、水平电泳槽2、离心机3、玻璃匀浆器5、恒温箱 &微量移液器7、吸量管四、材料与试剂1、小白鼠（成年）2、白瓷盘3、剪子4、镊子5、载玻片6、滤纸7、生
4、理盐水8、0.01mol/l pH7.4 磷酸钠缓冲液：取 0.01mol/L NaH2PO419ml 和 0.01mol/L Na2HPO481ml 混合即可。9、 0.05mol/l pH8.6巴比妥钠盐缓冲液：称取巴比妥钠 10.3g,巴比妥1.84g,加 蒸馏水溶解并稀释至 1000m1，pH 为 8.6。10、 0.5 %琼脂糖：琼脂糖0.5g，巴比妥钠盐缓冲液50ml，蒸馏水 48ml,10mol/lEDTA2ml , 水浴加热溶解。11、 染色液（以每块凝胶板用量计算）：取LDH酶活性染色液0.5ml, 0.5%琼 脂糖（预先已溶化）0.5ml混匀，临用前10分钟配制，避光保存3
5、7C恒温箱内。12、LDH酶活性染色液：NAD+ （氧化型辅酶I） （5mg/ml） 2.5ml、NBT （氯化 硝基四氮唑蓝）（1mg/ml） 7.5ml、PMS （吩嗪二甲酯硫酸盐）（1mg/ml） 0.5ml、 1mol/l 乳酸钠 2.5ml、0.5mol/l Tris 缓冲液（pH7.0） 3.7ml、0.1mol/lNaCl 1.3ml、 加双蒸水 25ml。13、 脱色固定液：95%乙醇140ml、1%或5%冰乙酸10ml、蒸馏水50ml。五、实验步骤（一）、LDH的提取取成年小白鼠断头杀死,任取下列组织：心、肝、肾、脾、肺、胃、肠、舌、 骨骼肌和性腺,用生理盐水洗去血迹,称取以
6、上组织0.1 克加 20 倍体积0.1mol/INaPB（pH7.4），用玻璃匀浆器在冰浴上匀浆，匀浆经3000rpm离心20min, 取上清液用于电泳分析（在4 °C冰箱保存备用）。（二 ）、凝胶的制备取溶化的0.5%琼脂糖2.5ml，加至干净的载玻片上，凝固后即可使用。（三）、加样将普通滤纸剪成12X1.5mm的细条，用微量移液器取LDH提取液10 15卩l, 将剪好的滤纸条充分浸润后，平贴在距载玻片一端的约 1/3处。（四）、电泳将凝胶板移入平式电泳槽内， 点样端在负极， 加入巴比妥钠盐缓冲液， 两端 用四层已浸透缓冲液的纱布“搭桥”。电压120V，通电40 45min。（五）
7、、染色与固定电泳完毕，每块凝胶板上立即加上预先配制好的染色液1.0ml，均匀覆盖，于37C恒温箱内保温30 60min，至有清晰的蓝紫色带区出现。将凝胶板放入5%乙酸中固定30min,再用蒸馏水漂洗2 3次，待背景无 色后，即可用于定量或扫描等处理。LlTLTLLOHrrLITl-HH,图1 LDH同工酶PAGE活性染色示 意图1、正常人血清2、猪心提取液3、猪骨骼肌提取液六、注意事项1、 LDH属于胞内酶，通过匀浆破碎细胞释放出LDH，像肌肉、胃、肠等较难 破碎的组织，匀浆时间可适当延长。2、铺板时应注意将载玻片放平，用吸量管吸取 2.5ml溶化的琼脂糖，一次放入 载玻片中央，让其向四周扩展，这样形成的胶面光滑平整。3、 浸润LDH提取液的滤纸条，要用镊子夹住贴在据载玻片一端的1/3处，注意 与载玻片一端平行。参考文献1、张龙翔、张庭芳、李令媛，生化试验方法和技术（第二版），高等教育出版社， 1997 2、袁玉荪、 朱婉华、 陈钧辉，生物化学实验，高等教育出版社，19883、刘粤梅、 朱怀荣，生物化学实验教程，19974、黄如彬、丁昌玉、林厚怡 ，生物化学实验教程，19955、 陈钧辉、陶力、李俊等，生物化学实验（第三版），科学出版社，2003