蛋白质分子量的测定.docx

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1、常用蛋白质分子景测定方法概述摘要：分子量是生物大分子的的基本属性之一，目前有许多方法可以对蛋白质分子量其进行测定。本文主要对较为常用的凝胶过滤层析法、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法、粘度法和生物质谱法进行介绍并总结每种测定方法的优劣。关键词：蛋白质，分子量，测定Abstract: Molecular weight is one basic parameter of biomacromolecules. Today there is handful of methods to determine the molecular weight of proteins. This review will i

2、ntroduce four most widely-used methods: gel-filtration chromatography, gel electrophoresis, viscometric method and the biological mass spectrometry technology, of which the strengths and weaknesses will be briefly summarized.Key words :protein, molecular weight, determination引言测量目标蛋白质的分子量是许多领域在实验、 科

3、研过程中必须面对的问题， 因此，掌握 常用蛋白质分子量测定方法， 熟悉各个方法的优缺点和使用条件是很有必要的， 本文主要就 四种常用蛋白质分子量测定途径进行总结和评价。一、凝胶过滤法凝胶过滤法又称凝胶排阻层析或分子筛层析，是上世纪60年代初发展起来的一种简便而有效的液相柱层色谱技术。利用某些化学惰性的多孔网状结构的物质（凝胶）为填料，通过洗脱液的连续洗脱，使混合物中的各种物质按其分子大小不同得到分离。分子量打的物质由于直径大于凝胶网孔，被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快，故最先流出；而分子量较小的物质纸巾小于凝胶网孔，可以完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，流程

4、长，速率慢，所以最后流出。这样，样品经过凝胶层析之后，各个组 分便按照分子量大小的顺序一次流出，达到了分离的目的，也为分子量的测定提供了理论依据。倪菊华主编生物化学与分子生物学实验教程北京大学医学出版社在凝胶过滤层析中，定义总床体积（Vt）为凝胶柱总体积，外水体积（ V。）为层析床中凝胶颗粒间隙间的液体体积，实际操作中，常用蓝色葡聚糖-2000 （bluedextran2000 ,分子量为200万）作为测Vo的参照物，定义Vi即为凝胶颗粒内部所含水的体积。某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系用有效分配系数Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo） 来表示。Kav是判断分离效果的一个重要参

5、数，同时也是测定蛋白质分子质量的理论依据。对于 同样的凝胶，在一定分子量范围内，各个组分的Kav与其分子量的对数呈线性关系。通过将以下已知分子量的蛋白质标准物在同一凝胶柱上进行洗脱，测定Kav并绘制标准曲线，通过,2008.5: 21标准曲线即可求出其分子质量。1凝胶过滤层析的优点有:1. 不改变分离物质的特性。凝胶过滤层析过程中，被分离的物质主要是通过凝胶柱来 进行分离的，而凝胶多是不带电的惰性物质，与被分离的物质不会发生物理化学变 化，能使被分离物质维持原来的结构而不变性，这在一些生物化工、医药领域内尤 为适用。如蛋白质的分离、抗凝血多肽的分离等。2. 分离条件要求不高。在凝胶过滤层析过程

6、中，由于凝胶的惰性，对温度、压力等操 作要求一般不需要高压或高温，所需的分离条件比较温和，可以在低温或者常温下 操作。3. 应用面广。在凝胶过滤层析分离过程中，只要选择不同的凝胶就可以分离不同的物 质。凝胶可以是亲水性的，如交联葡聚糖、聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶，用于分离水 溶性的生物分子或高聚物分子；也可以是疏水性的，如聚苯乙烯凝胶，用于分离疏 水性有机化合物。由于凝胶的种类很多，所分离的物质也很多，从分子量来说，可 以从几百到数百万，特别是活性大分子的分离。4. 凝胶层析分离设备的结构简单，易于操作，周期短，分离操作后介质不需再生，可 连续使用。5. 凝胶过滤层析操作的重复性好、样品回收率高。

7、通过控制凝胶孔径大小就可用来分 离不同大小的分子，分子量测定精密度较好。凝胶过滤层析的缺陷是会使样品大大稀释，同时若要获得重复可靠的结果，应严格控制实验条件和操作。二、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE在溶液中，带点的颗粒（例如蛋白质）会在电场的作用下运动，对于同一电场强度和电 极缓冲液，蛋白质的移动速率取决于其带电量和自身分子大小。若能使不同蛋白质所带电荷量相近，那各种蛋白质的移动速率便只与其自身大小相关，继而能够一次测量蛋白质分子量的大小。1967年Shapiro等人发现，若在聚丙烯酰胺凝胶 （PAGE中加入十二烷基硫酸钠 （SD0 , 不仅不会影响凝胶的形成，SDS还能打开蛋白质

8、分子间的氢键和疏水键，使蛋白质变性成为 松散的形状。同时大多数蛋白质中的每个氨基酸都能与固定量的SDS结合，形成 SDS蛋白质复合物。所以SDS的加入带来两大影响：1.由于SDS带有大量负电荷，掩盖了蛋白质原有 电荷，使得复合物电荷密度相近；2.SDS使蛋白质变性并形成复合物后，改变了蛋白质的原有构象，使所有的蛋白质都近似椭圆柱状，为电泳分离蛋白质、 测定蛋白质分子量创造了有利条件。潘文群主编化工分离技术化学工业出版社,2009.08 : 152-153 陈电容主编生物化学与生化药品实验，化学工业出版社，2007: 1201969年Weber和Osborn用此方法测定了约 40种蛋白质待测蛋白

9、质的迁移率，发现迁 移率同分子量的对数呈直线关系，这是SDS-PAGE定蛋白质分子量的理论依据。在分子量测定时，通常会选用已知分子量的蛋白质标准物（Marker）与待测蛋白质在同一条件下进行SDS-PAGE电泳，将已知分子量的标准蛋白的相对迁移率，在半对数坐标纸上与分子量的对 数作图，可得到一条标准曲线。按照该标准曲线即可得出待测蛋白质的分子量。王晓华，朱文渊生物化学精要与技术原理，科学出版社，2010: 128-129为提高SDS-PAGE勺分辨率，在均一浓度凝胶的基础上又发展出 SDS-PAG瞬度凝胶电泳。 凝胶的浓度线性增高， 蛋白质分子在电场中沿凝胶浓度由低向高泳动。 泳动过程中凝胶的

10、孔 径越来越小，蛋白质分子所受阻力越来越大， 不同大小的蛋白质颗粒将分别被阻滞在孔径与其分子大小相当的凝胶区段，而不再泳动。样品中分子大小相同的同一组分将在电泳的过程中逐步集中在凝胶的同一区段，而得以浓缩，形成狭窄而清晰的条带。谱带一旦形成后，其位置不因电泳时间延长而改变，这一点很适合蛋白质印迹的要求。此外，梯度凝胶电泳的另一个优点是在同一块胶上蛋白质分离的分子量范围增大，如一块具4%30%梯度的凝胶上可同时分离分子量为 5X 1042X 10华中农业大学生物化学精品课程组，« SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量，2003.09 刘松财，张明军，李莉主编生物化学实验技术，

11、吉林大学出版社,2010.06. 董迨传、郑新生物理化学实验指导河南大学出版社的不同蛋白质。黄璐琦主编分子生药学，北京大学医学出版社，2006: 152这一技术改进大大提高了 SDS-PAGE 电泳的分离能力。SDS-PAGE!胶电泳有如下优点：1. 检测灵敏度高，精度高。最低蛋白质检测量可达1mg。这是由于蛋白质同染色物质结合后吸光系数发生明显变化所致。2. 测定简便、快速，所用试剂种类少。不需像 Lowry法那样费时和严格的控制时间。3. 干扰物质少，重现性好。常见离子、缓冲液、硫基乙醇等物质均不会对本方法产生 干扰。同时SDS-PAG眺的应用亦存在一定的局限性：1. 对于不同范围的蛋白质

12、分子量的测定需要配置不同浓度的SDS-PAG避胶。例如15%的凝胶适用于分子量在 10k-50k范围的蛋白质；5%的凝胶适用于分子量在 25k-200k 范围的蛋白质；而 3.33%凝胶的孔径更大，适用于分子量更高的蛋白质的测定。使用时应根据待测蛋白的分子量范围选用合适浓度的凝胶，以获得更好的效果。62. 如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4gSDS/1g蛋白质的比率并具有相同的构象，该方法就不能得到准确的结果。影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下三个：（1）只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。一般以疏基乙生物化学实验技

13、术醇作还原剂。（2）溶液中SDS的总量，至少要比蛋白质的量高三倍，一般须高至10倍以上。（3）溶液的离子强度应较低，最好不能超过0.26,因为SDS在水溶液中是以单体和分子团的混合体而存在的，SDS结合到蛋白质分子上的量，仅决定于平衡时SDS单体的浓度而不是总浓度，而在低离子强度的溶液中，SDS单体具有较高的平衡浓度。3. 有些蛋白质是有不同亚基组成的（如血红蛋白），它们在SDS和疏基乙醇的作用下，解离成亚基而独立存在。因此，对于这类蛋白质，SDS凝胶电泳测定的只是它们的亚基分子量，而不是完整蛋白的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子中亚基的数目等，与SDS凝胶电泳的结果相

14、互参照。7对于带有较大辅机的蛋白质（某些糖蛋白）、结构蛋白（如胶原蛋白）等，由于不能定量的与SDS结合，因而测定结果偏差比较大，故也不适合用SDS-PAGEt测定其分子量。4. 由于SDS的加入会使得待测蛋白质变性，故分离所得蛋白质往往失去其原有构象。三、粘度法高分子物（例如蛋白质）在稀溶液中的粘度是它在流动过程所存在的内摩擦的反映，这种流动过程中的内摩擦主要包括：溶剂分子之间的内摩擦； 高聚物分子与溶剂分子间的内摩擦；以及高聚物分子间的内摩擦。用粘度法测定蛋白质分子量涉及以下概念：8名词符号物理意义纯溶剂粘度溶剂分子与溶剂分子间的内摩擦表现出来的粘度.溶液粘度溶剂分了与溶剂分子间、高分子与高

15、分了键和高分了与溶剂分子之 间,三者内摩擦的踪合表现。相对粘度邛集溶液粘度对溶剂粘度的相对值，增比粘度玮产爪T高分了与高分了之间纯溶利与高分子之间的内摩擦效应比浓粘度舄C单位浓度下所显示出的粘度特性粘度71反映高分子与溶剂分子Z间的内摩擦将ln Y r/c定义为比浓对数粘度。为了消除高聚物分子间内摩擦的作用，必须将溶液无 限稀释，使高聚物分子互相远离，消除高聚物分子之间的内摩擦力。当浓度c趋近零时，比浓粘度趋近于一个极限值，反映出高聚物分子同溶剂分子之间的内摩擦，即：limJ。 ( Y sp/c) = Y式中门被称为特性粘度，与高聚物的浓 度无关。在足够稀的溶液中有：门 sp/c= M + k

16、3 2c(1)ln Y r/c= Y - 3 ri 2c(2)以门sp/c及In Y r/c对c作图得两条直线，这两条直线在纵坐标轴上交于一点，可求出门数值。(如图)实验证明，当高聚物、溶剂和温度一定时，Y的数值只与高聚物平均相对分子质量M有关，有半经验方程 Mark Houwink方程：r = KM(3)式中K为比例常数，a是与高聚物分子的形状有关的常数。a值一般在0 . 5- 1之间。聚乙烯醇的水谄液在 25oC 时，a= 0.76, K = 2X10 2；在 30C时，a= 0.64, K = 6. 66X 一210 。利用粘度法测定高聚物粘度的方法主要有三类：(1)(2)(3)用毛细管

17、粘度计测定液体在毛细管里的流出时间；用落球式粘度计测定圆球在高聚物溶液中的下落速度； 用旋转式粘度计测定液体与同心轴。测定高分子的Y时，以毛细管粘度计法最为常用和方便。液体在毛细管粘度计内因重力作用而向下流出时，根据泊肃叶(Poiseuille)定律可知：V为流经毛细管液体的体积；r为毛细管半径；p为液体密度；l为 毛细管的长度；t为流出时间；h是作用于毛细管中溶液上的平均液柱高 度，h = (h+ h2)/2; g为重力加速度。9当液体流动速度比较慢时，可以忽略动能的变化，则液体的重力势 能将全部用于克服分子间的内摩擦力。对于同一个粘度计h、r、l、V均,1997,09为常数，则有：9Y =

18、 K' p tK '为与实验条件相关的常数。由于液体为高聚物的极稀溶液，溶液密度p与纯溶剂的密度p 0可视为相等，则可以进一步简化：Y r=听=K'所晶*给由此可见，通过粘度法只要测量出t、to和c,根据（1）式（2）式作图求出Y,便可由（3）式求出高聚物（蛋白质）的 M。粘度法的优点有：1. 所用仪器简单，测量周期短。不需要昂贵的电子设备即可完成分子量的粗略测定。2. 操作方便，原理易懂。3. 不需要标准品，也不需做出标准曲线。粘度法亦存在明显的不足：1. 实验干扰因素多，重复性差。毛细管粘度计的选择、人工时间的测量，温度、溶液 浓度等等因素都会对实验结果产生影响。2

19、. 准确度一般。主要实验数据由手工测得，实验准确度难以同电子设备相比较。3. 只能测出溶质分子的平均相对分子质量，无法得到样品分子量分布情况。四、生物质谱技术1906年，Thomson发明了质谱技术，最初只是用于无机化学中的同位素分析，直至20世纪40年代末才发展成为有机质谱。近年来，生物质谱技术取得了突飞猛进的发展，其中以 分别由美国科学家John.B,Fenn日本科学家田中耕一发明的电喷雾离子化质谱技术（ESI-M0及基质辅助激光解吸电离质谱技术（MALDI-MS）的贡献最为突出。（一）电喷雾离子化质谱技术（ ESI-M0 谭和平，王或婕，邹燕，谭福元，徐文平蛋白质分子量测试方法概述，中国

20、测试，2011,2电喷雾离子化质谱技术（ESI-M0是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场 使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相的质谱技术。ESI-MS的优势在于：1）对样品的消耗少，不会造成样品的大量浪费；2）对样品分子质量测试灵敏度、分辨力和准确度都相当高；3） 能够方便地与多种分离技术联用，如毛细管电泳、高效液相色谱等，是解决非挥 发性、热不稳定性、极性强的复杂组分化合物的定性定量的高灵敏度检测方法。ESI-MS缺点在于对样品纯度要求高，且会形成多

21、电荷的质谱峰群，难以分辨，使得结 果分析较为困难。张天幕.电喷雾电离质谱及其在蛋白质化学研究中的应用，生命科学仪器，2004 （5）: 21-25（二）基质辅助激光解吸电离质谱技术（ MALDI-MS）基质辅助激光解吸离子化质谱激光解吸电离质谱（LDI- MS）早已被作为分析难挥发有机物的手段之一，曾用于分析合成聚合物和热不稳定生物小分子的研究。但是激光解吸测定的分子量均低于 3kDa,这是因为只有化合物能较好地吸收激光时才能产生解吸，对于吸收激光不好的化合物就要加大辐射能， 这样大量的能量沉积到样品分子上， 就会破坏其结构， 使 分子离子峰变弱.所以LD1 MS用于生物大分子的分子量测定受到

22、很大的限制。一直到1988年，Tanaka和Hillenkanp两组科学家分别用基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI- MS)后才使得LDI-MS应用于生物大分子的分析得到发展.MALDI通常与飞行时间质谱联用构成 -12MAIDI-TOF-MS。13MALDI-M S的优势在于：1) 同ESI-MS 一样对样品的消耗很少；2) 随着质量分析器的不断改进、新的基质的不断发现和应用以及延退萃取技术的使用，使得MALDI-MS的最高分辨率不断提高，甚至超过ESI-MS 李越中，闫章才，高培基主编基因组研究与生物信息学山东大学出版社,2001.11 同10 贾韦韬生物质谱新技术与新方法及其在蛋白质组

23、学中的应用研究复旦大学，20063) MALDI-MS单电荷峰占主要部分，碎片峰少，非常有利于对复杂混合物的分析， 且能忍受较高浓度的盐、缓冲剂和其他难挥发成分，降低了对样品预处理的要求；4) MALDI-TOF-MS质谱对生物大分子分子量的测定范围是所有测试技术中最广的。MALDI-MS目前存在的不足是，在与高效液相色谱、毛细管电泳等分离设备的联用时，目前只能采取离线的方式，致使分析结果的重复性较差，与MALDI-MS本身高精密度的特性不匹配。结束语蛋白质分子量的测定是一切相关研究的前提，在过去的几十年中，蛋白质分子量测定的方法已经获得了飞速的发展。相信随着科技的发展，技术的进一步完善，以E

24、SI-MSMALDI-MS为代表的高精度测定方法必会将蛋白质研究工作带入一个全新的纪元。参考文献：1 倪菊华主编生物化学与分子生物学实验教程北京大学医学出版社，2008.5: 212 潘文群主编化工分离技术化学工业出版社,2009.08 : 152-1533 陈电容主编生物化学与生化药品实验，化学工业出版社，2007: 1204 王晓华，朱文渊生物化学精要与技术原理，科学出版社，2010: 128-1295 黄璐琦主编分子生药学，北京大学医学出版社，2006: 1526 华中农业大学生物化学精品课程组，SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量，2003.097 刘松财，张明军，李莉主编生

25、物化学实验技术，吉林大学出版社,2010.06.8 印永嘉主编大学化学手册.山东科学技术出版社.1985:6929 董迨传、郑新生物理化学实验指导河南大学出版社,1997,0910 谭和平，王或婕，邹燕，谭福元，徐文平蛋白质分子量测试方法概述，中国测试，2011,211 张天幕.电喷雾电离质谱及其在蛋白质化学研究中的应用，生命科学仪器，2004(5):21-2512 张天幕.电喷雾电离质谱及其在蛋白质化学研究中的应用，生命科学仪器，2004(5):21-2513 同1014 贾韦韬生物质谱新技术与新方法及其在蛋白质组学中的应用研究复旦大学，20068印永嘉主编大学化学手册.山东科学技术出版社.1985:692