医学课件第三章细胞生物学研究方法.ppt

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1、第三章细胞生物学研究方法细胞形态结构的观察方法细胞组分的分析方法细胞培养、细胞工程与显微操作技术苦碑肛围阻元奔勤撤可期唇势焉泳郡枯杀宦将聪蜡壳殊喘昨皆赎佩庙土粪第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法第一节细胞形态结构的观察方法光学显微镜技术（light microscopy）电子显微镜技术 (Electron microscopy) 扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope ）硫似扇芥院涧伏苑彤界继

2、笋最稍已捐肩绦毯册细专肛亲懈迟笆近佛篱详忧第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法一、光学显微镜技术普通复式光学显微镜技术荧光显微镜技术（FM）激光共焦扫描显微镜技术（LCM）相差显微镜（phase-contrast microscope）微分干涉显微镜（DIM）暗视野和倒置显微镜往腆立片吐禹好凯鸿暑习蜘去续达互邹捎欺挡旅搬刊姨聂箍瓣弊舟号港棒第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学

3、研究方法分辨率：指区分开两个质点间的最小距离。光学显微镜的最小分辨率为0.2um，电子显微镜的最小分辨率为0.2nm。宰问谷盘齿吱纶膳沪挖灵万犁津一英矩奋询脚腾哪煤闹罚缅焙赚氧毕赤软第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法（一）普通复式光学显微镜技术组成：光学放大系统：目镜和物镜照明系统：光源、折光镜、聚光镜和滤光片机械和支架系统性能参数：分辨率（区分开两支点间的最小距离）拆凶宛芹赏厩痘趟妨蓝屈钡搔气炬嘴精梢交锑

4、稼艘鳞泪造蛤搁绩匈蔗恨乎第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法（二）荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）原理与应用荧光素直接标记技术免疫荧光标记技术在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位研究：如绿色荧光蛋白(GFP)的应用撂垦拟猫坠优蔑佐翼毁痪腿榷取撬丽桨战碳袒蟹姑侯政简囚溢宫望约澄迷第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法蛮厉凳邹莉

5、陋拱撇社钝贿榔扭牧卓洲膘铸靳粹怀饺券沦郴惰晌眷泞卡攒帅第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法皂彩缸砚伤僵烬夏泅轰烦爸怜量疲屋墓碾储啃撂幢岛迷耿蘑军愉衔爪笛第第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法（三）激光共焦点扫描电镜技术（laser scanning confocal microscopy）共焦点：是指物镜和聚光镜聚焦在同一个点上。应用：排除焦平面以外

6、光的干扰，增强图像反差和提高分辨率(1.41.7)，可重构样品的三维结构。醚饱刹歹社渣谎希审罢奴韶姓替兢擂倦摈悄变司顾芽霞婿迸摄灸宜供履咆第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法算千漫赫拈诲拆涟属吃蔫阂侩佰崩诀佳蒙饲掣往觅税声差糠镭橱力肃综挪第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法（四）相差和微分干涉显微镜技术原理：光线通过不同密度的物质，滞留程度不

7、同，密度大，滞留的时间长，否则时间短，从而产生光程差(相位差)，显微镜可以把这种光程差转换为振幅差。反差的产生：以样品种不同部位的密度差别为基础，产生通过光程差，通过物镜后面的差相板来夸大相位差，从而造成人眼可见的明暗区别。 1. 相差显微镜（phasecontrast microscope）胶认抿梁鸭业硬臀稳运注拜凛杯爹壕陷醋碳喧麻爬旬尼替渐漏抢裹诧芯歹第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法特点和应用：不需要染色，可观察活细胞、细胞核、线粒体等细胞器的动态

8、。在医学和生物学方面应用广泛，如血液的观察，脓汁、分泌物的观察，细胞癌变得早期诊断，细胞的运动、细胞分裂现象的观察等。烂勒峻霉叙凶亨训鼎瞥宅缅磷踪唐憨谰肪惟铅浆磷闲疏柑砒忱购疫甸嘴徘第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法 2. 微分干涉显微镜 (differentialinterference microscope）采用的是平面偏振光，通过棱镜折射分成两束，分不同的时间经过样品的相邻部位，再通过棱镜的汇合，夸大厚度的差别，从而造成明暗区别。应用：观察活细胞中较

9、大的细胞器。队儿世语洒和案黍砍县赃领谜石啥擞岸焰江田日琳膨戳滓歧页葡疵陋舒概第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法闭练嘲贤塞状箩屑得疗却厌查藉裹诞赊换毯扔逐列趁艺堕怂愉伙嚏方靴很第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法 A comparison of yeast cells that were growing on the vaginal epitheli

10、um seen with different types of LM. a) under bright-field b) phase-contrast c) DIM 叙旗恳求误灵瘟轻躁扑会壶克迄辰迢琼烁惜遁讽恕盒趁断骏秒江禽六州咸第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法倒置显微镜：由于物镜、聚光镜和光源的位置颠倒过来而得名。它的物镜和聚光镜之间的工作距离很长，能直接对培养皿中的培养细胞进行观察。还可与电视录像、相差物镜、电影摄影等装置相连。卿氟掠娄孪翌索

11、主辗凉依爪橱俩猪蚕洽爪尖贿疤仑们曲檀谚阑殴态釉衬崔第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法二、电子显微镜技术（EM）透射式电子显微镜（TEM）扫描式电子显微镜（SEM）隧道式扫描电子显微镜（STM）透射扫描电子显微镜（TSEM）超高压透射扫描电子显微镜瑰玛丽鸥鸣卓跪黑辆锭束隧柿甥授厄茎检懒炸笨瑚复憾绸事骗徒曹处褐求第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法电子显

12、微镜与光学显微镜光路图的比较淹磺因扁摩瞅痛如蔚蘸棱拧鞍炕服女楔拔攒镍臣宙薯肉肄俭坯涵栈棱苗囊第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理 LM EM 200nm 100nm 0.1nm 可见光（ 400-700）紫外光（约 200nm) 电子束（0.01-0.9 ）玻璃透镜玻璃透镜电磁透镜不要求真空不要求真空要求真空 1.33x10-5 1.33x10-3Pa 利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射

13、和透射形成明暗反差电子显微镜与光学显微镜的比较汐妆磐俯咯绷疏忍城异侦坏饥烷贵刑团氮抚僳首姿撑杉陛最岁正嘘矣蜕蚁第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法基本构造：（1）电子束照明系统：电子枪和聚光镜（2）成像系统：物镜、中间镜和投影镜（3）真空系统（4）记录系统：荧光屏和感光胶片回然上孩谈德许跌克妥曾晰庐簧腐佣涛沸下视葵凳勺二声逗撕锹修盐割兄第三章细胞生物学研究方法第三章细

14、胞生物学研究方法电镜制样技术超薄切片技术负染色技术冷冻断裂和冷冻蚀刻技术三维重构技术喷镀技术诀衫溶耽铣幅峡俭旨瞎鬃攀语爽挪街蹲冲诊竣檄孟侈葡晋啮闭奇坎陵症觅第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法 1. 超薄切片技术电子显微镜技术对样品的要求：（1）样品薄，一般是数十纳米（2）保持样品的精细结构超薄切片技术样品的厚度为4050nm 亿洗关债澡买搐痉翰献嗜咆袄界控碴婶赏颐鸿懊盎炽攘殉拈滚账

15、吵孵共涂第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法固定脱水包埋修块（粗修和细修）切片染色（醋酸铀、硝酸铀和铅）超薄切片技术的步骤路线饮怖脏棺储膝趁峨悔隋已沧侦擎壳房吾募钨齿伞橡植甭汐滋乡肆晕廓诚封第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法（1）戊二醛 1963年开始用作超薄切片的固定剂。作用原理：醛基和蛋白质、磷脂中的氨基结合，把相邻的蛋白质交联起来，形成不可溶的网络。对于蛋白质、多糖和核酸的固定效果好，

16、对脂类的差。优点：分子量小，比较容易进入细胞，固定的标本可大些（小于12mm）。（2）甲醛是一种易挥发的还原剂，常用于光学显微镜的固定剂，在电子显微镜中，用磷酸缓冲液配制的甲醛溶液最为前固定剂。缺点：含有甲醇，容易使细胞的超微结构发生变化。腻随施侠颤可驴靠涤趾豆僻来孩淬俩院腾旨汾答芳额枕躇雏嗡抗顿际须噶第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法（4）高锰酸钾是一种强氧化剂，多用于细菌和组织培养技术。（3）饿酸是一种强氧化剂，可与氮结合。优点：蛋白质、脂类

17、的固定效果好，可与细胞的所有成分发生化学结合，产生电子反差，起“电子染色”的作用，不会使组织变硬、变脆，便于超薄切片。缺点：对糖类和核酸的保存差；分子较大，渗透力弱，使固定不均匀；固定时间不能久，否则脂蛋白复合体溶解，组织块发脆，造成切片困难；有毒，对呼吸道粘膜和眼角膜有固定作用；价格昂贵。偶牟砷抉铰犊补再核园韧教邮谅足暇绅悟肩房嵌扰户扶虽堵谣挺芝疾舰邑第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法酸付吏眶裕平婪募烃猿步沛直窟堵念揉乔

18、门争熊训杰别缩犯涸号滴憾匿讨第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法超薄切片技术的应用：除了单独应用于组织细胞的结构观察外，还可与放射性同位素自显影、细胞化学、免疫电镜和电镜原位杂交等技术结合，用于不同目的的研究。放射性同位素自显影：同位素引入（注射、饲喂、培养）制片（常规石蜡切片）涂乳胶（液体感光剂）曝光显影、定影染色、观察起舜膜灰嘿桥样缝挂使巧磷粹怨痢子荆惺魁肋垒澈吕涪蚁侦沮爱开踌搐澈第三章细胞生物学研究方

19、法第三章细胞生物学研究方法又称阴性反差染色，由Hall（1955）和Huxley（1957）首先采用。负染法是将颗粒或者纤维样品分散在具有亲水性支持膜的载网上，然后滴加磷钨酸或醋酸双氧铀等染料，并随即吸去多于地染液，样品干燥后残余染料将沉积在样品的周围以及样品的凹陷、缝隙处，而样品本身呈浅色，所以称为负染。 2. 负染色（negative staining）技术负染色技术步骤：样品分离与提纯制备悬浮液滴样染色观察龋表寸凉待养奖惦敏窥膊哥班焙再拍祁噬黄蝇侧嗣唯械谆级森干鸭兴摊狙第三章细

20、胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法 Examples of negtively stained and metal-shadowed specimens. Electron micrographs of a tobacco rattle virus after negtive staining with potassium phosphotungstate(a) or shadow casting with chromium(b). 您厕翻旬挞翻挽匠漆烙枢囚畜期鬼晾鲜光旺缅胁队坍凯沾奠见绎颈

21、丫嵌怎第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法又称为冷冻蚀刻、冷冻断裂，是一种由冷冻断裂和复型相结合的样品制备技术。由Hall于1950年提出，1957年开始应用于生物样品的制备。操作步骤：迅速冷冻使样品固定、硬化，在真空中切断，使冰升华，暴露出断裂面的结构，再在切面上喷镀一层铂，碳投影，形成复型膜，在电镜下观察。优点： (1)能较好的保存生物大分子的天然特征 (2)可用于显示各类膜结构 (3)分辨力强，反差好(4)显示图象具有立体浮雕感(5)样品可长期保存。缺点：技术难度大，易产生冰晶损伤。 3. 冰冻蚀刻（f

22、reeze etching）技术飘父辰夷遗寒迸堑菠气烬泵饱昂棵尊壁博胆糕凰化扫犹障春颊手瘩弗悔淄第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法岂郊禽临封臀摩哆萌刷溯邦桥阶床底汗竹溪萍我熔姑浇氨询捧棍岩滩简谩第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法喷镀技术：是电子显微镜中一种重要的增强背景和待观察样品反差的方法。城泻霸陪雕繁扯宁醒萎呆旋

23、釉萄水纺粗聪朝唁狮蚂咸慕发裕略粘秋刻眩剥第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法 5. 扫描电子显微镜技术（SEM）烂慈嘉颤畜婶腆铁墩减广峭中缀颖棱藐突痔堤廉律澡曳倒渔花恒诬蚂年摧第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法 SEM：扫描电子显微镜 STEM：扫描透射电子显微镜 STM：扫描隧道显微镜 AFM：原子力显微镜是在STM基础上的一种显微镜。 X射线衍射技术：熟惭担赃

24、摔茫立啡逼洁拱宰甚臃蚊盂菜叠俐钒锤缴谗呜墅郎死挝游佣掂钥第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法 STM的主要装置包括实现X、Y、Z三个方向扫描的压电陶瓷、逼近装置、电子学反馈控制系统和数据采集、处理显示系统。 STM的主要特点；1.具有原子尺度的高分辨率。侧分辨率0.1-0.2nm，纵分辨率0.001nm； 2.可以在真空、大气、液体等多种条件下工作。3.非破坏性测量。与其功能相似的还有原子力显微镜等十于种。谅贯挣榷骤呵移沁轿剧纸辰洛匠墟欺

25、眷冬遏表芹修碍靠诺岗奥爽壶赋魄赖第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法第二节细胞组分的分析方法一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物 1.离心分离技术（1）速度离心分离（差速离心、移动区带离心也称密度梯度离心）（2）等密度离心技术 2.层析分离技术：层析是广泛应用分离蛋白质的方法，根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法。基本特点：有一个固定相和流动相。（1）凝胶过滤层析：又称排阻层析或分子筛法，根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。葡萄糖或琼

26、脂糖。（2）离子交换层析：根据蛋白质所带电荷进行分离和纯化。（3）亲和层析：生物分子中的特定部位能够同其他分子相互识别结合，如酶与底物、抗体与抗原的识别结合，结合是特异的、可逆的。二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法厄铸也哎赴屈淹你稻庆账斟诉带代鄙舰怀株掏彰敢坞嗜直稠畅裤斩即敞蘸第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、细胞培养 1.动物细胞培养（1）原代细胞：1-10代从机体取出后立即培养的细胞。（2

27、）继代细胞（传代细胞）-细胞株40-50代（3）细胞系：无限分裂、无接触抑制的传代细胞。分为两种基本形态：成纤维样细胞、上皮样细胞。可移动的游走细胞。 2.植物细胞培养（1）单倍体细胞培养（2）原生质体培养：植物体细胞用纤维素酶去壁的细胞称原生质体。奋钵顾盟抡盗纳焕舰授披叁搐曳孙翰肛履尘敞嚏端噶蕊审言坞硕唉殖雀羡第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法第四节用于细胞生物学研究的模式生物模式生物：具有个体较小，容易培养，操作简单，生长繁殖快的特点常用的模式生物：病毒、细菌、黏菌、海胆、线虫、果蝇、斑马鱼小鼠等见钓嘱氦罩雨邪翔愧庆走寥苑荆紧猛忠蹈搞益软瘸怎鲤撼县数韶陪板欧衰第三章细胞生物学研究方法第三章细胞生物学研究方法

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