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1、唾液乳杆菌Ren 抗胆盐胁迫反应机制及转录因子TF0225 在胆盐胁迫应激中的作用唾液乳杆菌是人体肠道内的原籍菌, 具有多种益生功效。肠道内的胆盐具有杀菌作用 , 能够破坏细菌的细胞膜结构, 造成蛋白质错误折叠和DNA氧化损伤 , 因此能够耐受生理条件下的胆盐胁迫是唾液乳杆菌在人体内发挥益生作用的必要条件。本研究采用转录组学与蛋白组学相结合的手段, 对长寿老人源Lactobacillus salivarius Ren胆盐胁迫反应中的差异表达基因和蛋白质进行分离鉴定 , 并对其中关键转录因子及其靶基因进行功能分析, 实验结果为全面揭示 L. salivariusRen 的胆盐胁迫应激机制提供理论
2、基础 , 研究内容如下： (1) L. salivarius Ren 胆盐胁迫条件下转录组和蛋白组图谱的建立。将 L. salivarius Ren在含有 0.07%牛胆盐 (Oxgall)的 MRS中进行培养 , 应用基于第二代高通量测序的RNA-Seq方法筛选了 192个转录水平显著变化的基因(log2 fold_change 1.5,p<0.001),其中 47 个基因的转录水平上调 ,145 个基因下调。同时采用蛋白质双向电泳(2-DE) 和质谱鉴定分离了44 个胞内可溶性差异表达蛋白点 (fold_change 1.25,p<0.05),其中表达丰度上调的
3、蛋白点15 个, 下调 29 个；并且 31 个蛋白点在翻译水平和转录水平同时呈现上调或下调。结果表明 L. salivarius Ren的胆盐胁迫响应是一个复杂的调控网络。(2) 生物信息学分析预测L. salivarius Ren的胆盐胁迫应激机制。利用Uniprot 、KEGG及 NCBI等数据库分析差异表达基因和蛋白质的功能及参与的代谢通路 , 提出了 L. salivariusRen的胆盐胁迫应激机制 , 主要包括：对麦芽糖和甘油的利用加强 , 加速糖酵解以提高能量物质的产生；增加赖氨酸与苏氨酸的合成 , 以加强对细胞表面的修饰提高细胞膜的稳定性；转运蛋白的合成上调以加速胆盐的泵出；
4、提高分子伴侣与氧化还原酶的合成, 应对胆盐造成的蛋白变性和氧化损伤；基因转录和翻译、 细胞分裂增殖及脂肪酸合成等进程减慢；通过转录因子及双组分系统调控细胞生理变化, 以适应胆盐胁迫环境。 (3) 转录因子 TF0225在 L. salivarius Ren胆盐胁迫应激中的调控机制。将 TF0225在 L.salivarius Ren 中进行同源超量表达 , 胆盐耐受实验表明转录因子超量表达菌株对 0.5%胆盐的耐受能力是对照菌株的 23 倍。进一步利用细菌单杂交和 MEME工具预测了 TF0225的 DNA结合位点保守基序 STKGMCA,并通过Target Explorer在 L. sali
5、varius Ren中筛选了 16 个 TF0225 的靶基因。采用RT-qPCR分析了关键靶基因 .oppA 的转录水平 , 结果表明转录因子超量表达菌株中 oppA 的转录水平显著下调2.33 倍, 证实了 TF0225对 oppA 的负调控作用。(4) 靶基因 oppA 在 L. salivariusRen 胆盐胁迫抗性中的功能分析。 将 oppA基因在 L. salivariusRen中进行同源超量表达 , 胆盐耐受实验表明oppA 超量表达的重组菌株对0.5%胆盐的耐受能力是对照菌株的20 倍。单一成份胆盐 (GCA、GDCA、TCA和 TDCA)的耐受实验表明 OppA可赋予重组菌株对牛磺酸结合胆盐特异的抗性。此外 ,OppA的超量表达还可显著提高L. salivariusRen对高盐 (7.5% NaCl)及高温 (55 。 C)胁迫的耐受能力。这些结果表明OppA在 L. salivariusRen对抗多重胁迫的过程中发挥保护作用。综上所述 , 本研究首次采用了转录组学和蛋白组学相结合的方法, 全面分析了 L. salivariusRen胆盐胁迫条件下基因与蛋白的差异表达情况, 为揭示 L.salivarius的胆盐胁迫应激机制提供了新的依据。