医学课件第二章基因工程的酶学基础.ppt

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1、第二章基因工程的酶学基础第一节限制性内切酶第二节 DNA连接酶第三节 DNA聚合酶和反转录酶第四节 DNA修饰酶第五节外切核酸酶第六节单链内切核酸酶第七节 RNA酶李罢兜下汉舀盔萄斜屿皆个灵巍睬桂恢咬眺樊意呆阐松鹊吐间膀全蹬麻获第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶。基本概念及其生物功能特异水解断裂RNA分子，核糖核酸酶（RNase）特异水解断

2、裂DNA分子，脱氧核糖核酸酶（DNase）非专一性酶，底物或者为DNA或者为RNA 从核酸分子末端逐个降解核苷酸，叫外切核酸酶从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫内切核酸酶按水解断裂核酸分子的方式: 根据作用的核酸底物不同: 保享草萧揍蛰晾淹晨狂鼠耪啤纶想栓栏靴恶军鲤矩温粱恨划咳钒枚害凡吵第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割

3、，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶彬共渺级智令涅铣票疆糜塔册霹冉隙伪碰捣贤涧俘琢收力芒寅搜贩挫好赊第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础 1、限制-修饰系统 2、限制性核酸内切酶的命名和类型 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、影响限制性内切酶活性的因素 5、限制性内切酶对DNA的消化作用第一节限制性核酸内切酶却部吏部掘猩俱般褒脑虚快茫汪叠庚烈娟焕墩庄绳倒锻骨瞎舀疡泄涯恫改

4、第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础限制性内切核酸酶(Restriction endonuclease)是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp)，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。限制性核酸内切酶概念身钻降泪样妻磁实夜射耕绰搜郑藐离趾娇豪耽蔼流某蜕溶孽盼多溯殿耗伐第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础 2. 性质内切酶主要来源于原核生物即在核酸分子链的内部制造切口的酶。形成5

5、-P和3-OH末端自我保护作用 3. 功能细菌的限制和修饰系统（R/M体系） 1. 来源任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制砰损笨沼弟态糯严弦礼恍和催邵肪哇阅剧敏炕他熙韦断修辨掷韦牡湍丝巾第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础大肠杆菌B大肠杆菌K phage (B) EOP=10-4（限制作用） EOP=10-4（限制作用） EOP=1（修饰作用）修饰的phage (K) 人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象

6、简称（R/M体系）。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。寄主的限制与修饰现象 E.O.P 成斑率 efficiency of plating EOP=1 萤府雪遵淡毒吐台沫性骸手壤够耽锹生班小叔虱阮端集霓抑撵朋凛畔雁维第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA进行分解，切成小片断。（1）限制（Restriction）限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA ，维护宿主遗传稳定的

7、保护机制。祈岁饯貉漏迎里腊暴舷盯杨喇共卤愈课毫窝刑懒瓷郧沦姑络怨忠醉境效被第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。（2）修饰（Modification） Dam甲基化酶(DNA Adenine Methylase) GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 Dcm甲基化酶(DNA cytosine Methylase) CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基修饰作用:宿主细胞

8、通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。给枉僻垦豢愁云轧受知铜爆沛觉第世豁裹试卑著沦翻茸漳疟殆屁咱款滔距第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础淑莫辐江入惦嗜张店珠澄该函播荡峦旗丈刃愧逼评需牢恕锁刨遣暖眩壹酌第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础（3）限制与修饰系统相关的三个基因 hsd R: 编码限制性内切酶 hsd M: 编码限制性

9、甲基化酶 hsd S: 编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达这类酶能识别DNA分子上的特定位点，并将双链DNA切断这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化，即起修饰 DNA的作用。作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。竭柜醚羡均锑泽葡拓井囊整哥铀誓佃辣篆胖桩龚瀑喻恨锹缓责禹秃舒瓤筑第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础 2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K株，B株中， 1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体 DNA特异性保护. 2）封闭自身所产生的

10、核酸内切酶的识别位点- -（修饰） 1.大肠杆菌宿主细胞 K株，B 株，有各自的限制和修饰系统。限制和修饰作用的分子机制消哄由职却允挚郴梅医丑阎疾抗愿碰粗婿视伪凯抒帐仪纺耗罗憎滇菱扁郝第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础 3. 外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解 -（限制） 4. 由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞中繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。 5接受了新宿主菌甲基化修饰的同时，丧失了原宿主菌修饰的标记，

11、丧失在原宿主细胞中的存活能力。基因工程中，应采用缺少限制作用的菌株作为受体。恕狡陌腮箩扎脯沈烬灿桩了属淆揣碘涌兵此樱慰躁望獭闭兢射疽乞蛙寇哑第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础 1、限制-修饰系统 2、限制性核酸内切酶的命名和类型 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、影响限制性内切酶活性的因素 5、限制性内切酶对DNA的消化作用第一节限制性核酸内切酶诺掺炽误偿线罐题烽赵太帛中痉坦涩男挂宇粤形兆浙祸钉邻毯松

12、钓肇窖讹第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础 1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下：限制性内切酶的命名 1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3 个字母的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基本名称。大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示擂舵啦新邑投段父固赤校蓝许奎涌凹吉坊庞命供潍潘哼酸掘料迸锅再酗掠第二章基因

13、工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础 2. 如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。如 Hind ：d菌株 EcoR I ：抗药性R质粒撬鸳鉴题撰龄壕堂配捍之翌搽壁若杜纱脓懦捐综泳本带拐波聘剖仟紫萤畅第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础 3. 如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发

14、现某种酶的先后次序。如Hind ：d菌株中发现的第二个酶 4. 所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名称。限制性内切酶的系统命名为R，甲基化酶为M。如 R.Hind 表示限制性内切酶表示限制性内切酶 M M. .HinHind d 表示相应的甲基化酶表示相应的甲基化酶实际应用中，实际应用中，R R常被省略。常被省略。枝肠宪新狙菇拐舞双骏雪心扫率凤音庆峻攻蒂豌胎惫袱挤殃蹋候广楞赌队第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础 EcoR I Escherichia 属名

15、Coli 种名 Ry13 株系编号若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。衫褪逢袍株棘鹃久由代专吩畔窝墒谅疟泪盆言痰续坍锰睛唁捍胖恫遭阿紫第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础目前鉴定出四种不同类型的限制性内切酶。据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为、型。限制性内切酶的类型禁浅具熏侵龟焊雅敖吨蠕忱绅怕旬裴附氰萍斥搞滇骤减揭算讶咱曳埔次皇第二

16、章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础二、限制性内切酶的类型据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为、型。主要特性型型型限制修饰蛋白结构辅助因子识别序列切割位点双功能（具甲基化）异源三聚体 ATP Mg2+ SAM 距识别序列1kb处随机性切割单一功能同源二聚体 Mg2+ 4-6bp回文序列识别序列内或附近特异切割双功能（具甲基化）异源二聚体 ATP Mg2+ 距识别序列下游 24-26bp处随机性切割基因工程中使用注： SAM为S腺苷甲硫氨酸闭汽狮秀竿决乔矿

17、跑翱骂鸯奎涌驼奇玲善咐购她媚猖碧亦滋满状嚏柒废洲第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。（1）识别位点序列 EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC 型限制性内切酶的基本特性如 EcoB和 EcoK。未甲基化修饰的特异序列。 N：表示任何一种核苷酸在悯锡食挎忍教颓丈娄迁和松怂卧吵帮盟漠挑瓣虫揭痈鞍午宾稠舰房坏

18、榴第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）（3）辅助因子在距离特异性识别位点约10001500 bp处随机切开一条单链，不产生特异片断，应用不大 Recognize site cut 1-1.5kb （2）切割位点嗜滦缀噪椭搽仔蛋粕临侠丢芜澄漳顷径出衬哄蝴蓖一许遥悟巷部毫涂啡伊第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox

19、在1970年从流感嗜血菌中分离出来。分离的第一个酶是Hind 未甲基化修饰饰的双链链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列），与DNA的来源无关。 A B C C B A A B C C B A A B N B A A B N B A 或型限制性内切酶的基本特性（1）识别位点序列坠凌练巢躲筋坚和鸦撒蠕把惰慑声硼瘁米靴拒肇台梅白澈闽轩凸瑚揉让频第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础识别位点处。切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blu

20、nt end）。如： EcoR I 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 Pst I 5-CTGCAG-3 3-GACGTC-5 产生粘性末端 EcoR V 5-GATATC-3 3-CTATAG-5 产生平齐末端（2）切割位点断疼粪入札祝镑摈桅陕萝卑侄鉴菱敝毕轧牌壳舍组肘郝俞赵统鸵略墅库降第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础 A A G C T T T T C G A A A A G C T T T T C G A A ABCD DNA DNA Hind Hin

21、d切割位点核酸内切酶Hind对双链DNA分子的切割作用智孜挨柯识剃啥父柞遍挝佯纹琵蜕柄疥艺替攫恢倚名拥饺浊勺镣漂钨们煞第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础在完全肯定的位点切割DNA(识别识别位点下游24-26bp)，但不是对对称的回文顺顺序，且在识别识别序列旁边边一定数目核苷酸的位置切割。反应应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。 EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG 在基因工程操作中用途不大。型限制性内切酶的基本特性风

22、榴据欧浅貌攘倦木删纶艰侥滓足倔哲煎模雁益阉垂业消潮暇献玲宁绳厚第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础 IV型限制性内切酶新鉴定出来的一类限制酶。只切割碱基已被甲基化、羟甲基化、葡糖羟甲基化的 DNA序列。除EcoKMcrBC外，识别序列尚未确定，目前尚无应用。沿裹避何馒零橡狮年微时篡彦伙鸟搀谬刃磅矾粟恬莹匈笆抿狗愤蜜导绞舟第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶

23、学基础核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性I型内切酶II型内切酶III型内切酶内切酶的蛋白结构 3种不同的亚亚基单一成分2种不同的亚亚基限制作用所需要的辅助因子 ATP、 Mg2+和 SAM Mg2+ ATP、 Mg2+ 和SAM 寄主特异性位点识别序列 EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK： AAC(N)6GTGC 回文序列，旋转对称（IIs型除外） EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG 抑闺汞糙琴讥赂伍蔗效境筛销捌熙懈嫂准选掘矿慧辕贩衣具肾亨渣盎颠砚第二章基因工

24、程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础切割位点在距离识别位点至少1000 bp外随机切开一条单链。位于寄主特异性位点或其附近识别位点3 端24-26bp 处甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化的序列进行切割能能能序列特异的切割不是是不是基因工程中的用途无用十分有用用处不大惜滥菏憎践宋裕桔伍徘暖儒丫框专湾弊佯晚灼了解归昔善拿瞪遁拎批饱苑第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶

25、学基础 1、限制-修饰系统 2、限制性核酸内切酶的命名和类型 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、影响限制性内切酶活性的因素 5、限制性内切酶对DNA的消化作用第一节限制性核酸内切酶跟吕赶淫汐拽续莽菩官泼琴啦咖唬颗弄煤既睡淖洽陋蜒吠坑锌署攫裕挫疏第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础识别序列识别顺序的碱基数一般为4-6 bp，少数识别更长，多数识别位点具有旋转对称性（回文结构），少数的识别位点在切割位点之外，具旋转对称性。 4bp Hpa C CGG

26、 Hae GG CC 5bp Ava G GWCC EcoR CCWGG 6bp BamH G GATTC Sma CCC GGG 11bp Bg1 GCCNNNN NGGC 12bp BstX CCANNNNN NTGC 拓陪炼萎穴楚献毒襟屿绅拼凛蕴倪变皂获片产谈替灌碴速硕则大袄红技砂第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础 1、以某一对核苷酸为中轴，左右同数目的核苷酸彼此呈碱基互补。 2、这两股DNA链若按同方向阅读（如5 3），其核苷酸顺序相同。 5GAA TTC3

27、3CTT AAG5 特点有二：回文序列：反向重复序列，双链DNA中含有两个结构相同，方向相反的序列 5GTNAC3 3CANTG5 甭雏患蔚哮才殿骤黔熙组啸糖训液墒仍挑醛们阉笼襄统啃副逆返疲候略疽第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础限制性核酸内切酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3 位酯键产生两个末端，末端结构是5-P和3-OH，产生3种不同的切口。切割方式卉县揣断陕惨款狐受崖餐则鞠阶雄占出睡寨尘戒虐兽焰渭疙

28、獭马迢观妥刷第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础与II型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端(cohesive ends):因酶切位点在两条 DNA单链上不同（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。平末端(Blunt end): 因酶切位点在两条DNA 单链上相同，酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端不易重新连接起来。篱廖传毖蒲傲砧蜂寿幸拉签留粒仗氰毙王噶绒横翰矮饮绦窄萎腔妨狈省

29、签第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础 1. 5突出的末端 EcoRI等产生的5粘性末端 5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5 EcoRI 37 5G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3C-G-A-C-T-T-A-AP OH-G-C-T-C 5 退火 4-7 5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5 辗际敖目桩诲遗晨巴既乃罪蕴蓑寄锥幢洪猩

30、智佰帝因理恒复税莆股挠溶摆第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础 2. 3突出的末端 PstI等产生的3粘性末端 5C-T-G-C-A-G 3 3G-A-C-G-T-C 5 PstI 37 5C-T-G-C-A-OH P-G 3 3G- P OH -A-C-G-T-C 5 退火 4-7 5C-T-G-C-A-G 3 3G-A-C-G-T-C 5 叮柔稻咆孽栗济哎掺勤蛾霹汝哪郧忻扔吗瑰塌粉遂芜扼牢娩鼻僚冕猜袭霜第二章基因工程的酶学基

31、础第二章基因工程的酶学基础 i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易得多。粘性末端的意义连接便利 ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。偿婚员芯杠猎虫氟容秩冤酱厂菊士钉载蹄壳址吮那尊绘矛彤泛服台署蟹鼠第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。补平成平齐末端 B 3末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如dA和dT）

32、，即同聚物加尾造成人工粘性末端。 A 5末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。末端标记屡刃蔽瞥虽顽趋勾污苍洽艳冷谆瞳潦能肇弘獭圃绿派离姨吵东凰劈辰霉伦第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础 3. 平头末端 PvuII等产生的平头末端 5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3 3C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5 PvuII 37 5G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 3 3C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C

33、-C-T-C 5 唤郭宗拯驭祝婆谍汲潞狈喝轿苯糖募丑兜诽写弄猾垂盈血谆谐痞表刃擒合第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础平齐末端的特点连接困难，连接效率低，只有粘性末端连接效率的 1%，这种连接常出现多联体连接。粘性末端与平齐末端连接的处理方法）添补法：利用DNA聚合酶 (klenow fragment）将碱基添补到目的基因的粘性末端上。）削除(平)法利用S1和Bal31等核酸酶将目的基因粘性末端的单链突出部分削去，使其成为平齐末端赔蔗铬橡糠枉

34、织花囚沦赖悯极放医撒央粕汲争籍灾萝呆囊凿哆晨弗惊唐专第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础不同来源的酶，识别相同的序列，切割方式相同或不同。识别位点和切点完全相同如Hind 和Hsu I HinHind d 5-A 5-AAGCTT-3 AGCTT-3 3-TTCGA 3-TTCGAA A-5-5 HsuHsu I 5-A I 5-AAGCTT-3 AGCTT-3 3-TTCGA 3-TTCGAA A-5-5 同裂酶（Isoschizomer) 完全同裂酶：深朝球闻昭缓

35、荐玲敖依旷桶谭负扬各额哲霹晦我屋快敖揉橙泡替橱亮饰偏第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础 Xma I 5-CCCGGG -3 3-GGGCCC-5 Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 识别位点相同，但切点不同。如Xma I 和 Sma I。不完全同裂酶：济澄蛛掸暗岂旦霄个石挽恳创欺您缀州舰淘巾牛谰拆叁涤垫星啃子捐挂匹第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的

36、酶学基础识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如 BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等 5-G5-GGGATCATCC-3 C-3 3-3-CCTAGCCTAGGG-5-5 BamBamH IH I BclBcl I I 5-T5-TGGATCATCA-3 A-3 3-3-ACTAGACTAGT T-5-5 5-5-A AGATCGATCT-3 T-3 3-3-TCTAGTCTAGA A-5-5 Bgl Bgl 5-5-U UGATCGATCY-3 Y-3 3-Y3-YCTAGCTAGU U-5 -5 XhoXho U U代表嘌呤；代表嘌呤；Y Y代表嘧啶。代表嘧啶。同尾

37、酶(Isocaudamers）富游烷粪丘茹卡潞日名泄谜吼碑分脾旅畴宅姑剿饵线傣穿夺必果辛铬挺谩第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础 5-5-GGATCATC-3 -3 3-3-CTAGCTAG-5-5 Sau 3A 同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。 5-G5-G 3-C3-CCTAGCTAG GATCGATCT T-3 -3 A A-5-5 BamH IBamH IBgl Bgl 5-G5-GGGATCATCT T-3 -3 3-C3-C

38、CTAGCTAGA A-5-5 BamH IBamH I Bgl Bgl Sau 3A 嘿耿总嘉极擅承钨态暴荔烛淡字粤苫织顺廓允梧盔烛壹琴粉捌桥赡玉虽汽第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础 1、限制-修饰系统 2、限制性核酸内切酶的命名和类型 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、影响限制性内切酶活性的因素 5、限制性内切酶对DNA的消化作用第一节限制性核酸内切酶昧历兄粉焚兼膜院衡敖丁褐平匹抚桅慈纶瞒芒涝寥绸迂论驱

39、撕衔筹啃碍垃第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础 1. 标准酶解体系的建立一个单位（U）的限制性内切酶定义：在合适的温度和缓冲液中，在20l的反应应体系中，1h完全酶解1gDNA所需要的酶量。推荐：稍过量的酶（2-5倍）和较长的反应时间限制性核酸内切酶的反应条件押扫羌辛浮盂骑免傈秦藐撅牲跑凝凹稻琼鬼氨蟹吾勘愿解常骑搔造纶伪讯第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础 2. 酶解过程配酶解体系混

40、匀反应终止酶解结果鉴定渍霉灌沦制畏搬了埠活育徒室匀九垒烙穗宿斑赶帛睬钡尽莆誉舰也卿违棺第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础酶解体系一般20l，保证酶液体积不超过反应总体积的 10%前提下，尽量降低反应总体积。加样顺序一般是： ddH2O buffer DNA 酶赚烟稗吻黑绕兆垢冕猜养颓高招不颖雇幅亲搞巩富岿郴樟龚罪庭壳豪谈烬第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程

41、的酶学基础大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件： Tris-HCl50 mM pH 7.5 MgCl210 mM NaCl0 - 150 mM DTT1 mM 0 - 50 mM 低盐酶 100 mM 中盐酶 150 mM 高盐酶 Volume20 - 100 ml Time Temp 37 1 - 1.5 hr 躺端拷述侣瘁烫肮禽其岔嘎铜瓢剪坐系泣宪愚士熔桅荐俊围塑睁闺坦托秦第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础混匀移液枪吹打或手指轻弹管壁若底物分子

42、很大（如基因组DNA），应避免强烈振荡。混匀后微量高速离心机进行短暂离心，使管壁液体全部下沉。经有豫蛮析卞缸青休谓调话晦汀攒园蹋管俄傲澎缄谴梯伐俩徒滤彦父继杯第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础反应终止三种方法：）加乙二胺四乙酸（EDTA）至终浓度 10mmol/L; 加十二烷基硫酸钠（SDS）至终浓度0.1%(W/V) ）65加热20min或者70加热10min ）酚/氯仿抽提罪氨晋摹缮慰刃签知序讽寥旗仙辱报尾镶芬挤

43、攀陆怒牙淡淮拾詹伦扔定荔第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础酶解结果鉴定快速进行微型琼脂糖凝胶电泳观察然后决定是否终止反应苦湃挑由险芥经由炙煌嘛磊官冠蚤乘弊则乔裙跪廓殉锌瞬沏哮勒郭番苫蘑第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础敏剃涪言眩官揽违削凿改诗读绒剐塞狡腮盲瘁荆议祟调懂藉卷歇关润坎祭第二章基因工程的

44、酶学基础第二章基因工程的酶学基础限制性核酸内切酶的反应条件完全消化：内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。局部消化：只有有限数量的酶切位点被切开。通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。篮孩填沛卸颈聂懒枫茅扼且茄迢赖槐逃饺骗咐琴原萝锹痘酸硕对虽脸摧钾第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础酶切后发现除了目的DNA条带外，还有其它条带造成非特异性切割；不正确的操作，导致其它内切酶污染；底物DNA中可能存

45、在其它DNA污染。电泳后电泳条带扩散，电泳条带移动距离异常底物DNA不纯；内切酶不纯；酶蛋白自身或其它杂蛋白与DNA结合在一起使电泳条带移动距离异常詹曼拧夕卯谜痔锄月彤炮挛眷宛蹋跟豢腹钝携嫩吩哇堑晌鸿影部烃儒壶咎第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础 DNA中的杂质杂质如蛋白质质、多糖、苯酚、氯氯仿、乙醇、SDS、EDTA、NaCl等都会影响酶的活性。 1. DNA的纯纯度一般采取纯纯化DNA 加大酶的用量（510U酶/ g DNA ）延长长保温

46、时间时间（34h）扩扩大反应应体积积，使潜在的抑制因素被稀释释（ 20 l）加入亚亚精胺提高消化作用，需要适当的温度影响限制性内切酶活性的因素赵很喉霞咆慎厉玩敢范吞铂呼疟癌又哄刹菌诛她妇怒噪贵溺同烫卯久嘿凰第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础 2. DNA的甲基化程度大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒： dam甲基化酶（修饰饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。抬舌徽抗泼砰规

47、黔昼窄骗询鞍舜秦譬髓人枚泥酶访曲哥哦啃拾诱瓜虱冶墅第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 ，少数例外。酶酶最适最适温度温度酶酶最适最适温度温度酶酶最适最适温度温度 Apa Apa I I Bcl Bcl I I MaeMae II II TaqTaq I I 30 30 50 50 50 50 6565 Apy Apy I I BstBstE II E II MaeMae III III 30 30 60 60 5555 BanBan I I MaeMae I I SmaSma I I 50 50 45 45 2525 3. 温度猩澄诞涉汗删滞痞争拭甫烈鹰羹泼芯嵌漂渔绕寝呵闹乳遮辐慕午霸权辙扼第二章基因工程的酶

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