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3、包裹9. 120，100kPa高压20min， 50-60 24 h烤干备用（2周内）常用溶液配制 DMEM溶液的配制1 制备新鲜三蒸水。过滤器装好0.22m滤膜，用三蒸水湿润，120，100kPa高压20分钟。2将一包DMEM培养基干粉倒入烧杯，用三蒸水洗包装袋内面2-3次，倒入培养液中，以保证所有干粉都溶解成培养液。磁力搅拌（1-2h）使之完全溶解。3 根据包装袋上的要求补加所需量的碳酸氢钠（0.02g）；根据实验需要，添HEPES（5-20mmol/L）、谷氨酰胺和其他特殊物质。4加入100U/mL青霉素和100U/mL链霉素。5必要时用1 mol/L 盐酸和1 mol/L 氢氧化钠调节
4、pH。加水定容至1L。pH 7.2-7.4。6 负压泵连接过滤器过滤除菌，分装于无菌100ml生理盐水瓶中（90ml/瓶），20冻存。配制好的培养液使用时，37复温，根据需要加入血清（5%-20%）培养细胞。HEPES(260.3) 15mMHEPES 3.905gDistilled water 1000ml(或直接加入1L培养基中)常用平衡盐溶液（balanced salt solution,BSS）配制方法(g/L)RingerPBSHanksD-HanksDulbeccoCaCl20.25-0.14-KCl 0.420.20.40.20.2KH2PO4-0.20.060.20.2MgCl
5、·6H2O-0.10-MgSO4·7H2O-0.10-NaCl 9.08.08.08.08.0NaHCO3-0.35-Na2HPO4·2H2O(269)-1.560.092.162.16NaH2PO4·2H2O-D-glucose-1.0-酚红-0.010.02-消化液配制0.25%Trypsin+0.02%EDTA(pH8.0 , 37)Trypsin (1:250) 0.25g EDTA 0.02g D-hanks(Ca2+/Mg2+ free) 100ml 0.22m滤膜过滤除菌后分装于高压灭菌过的小青瓶中。-20冻存。Cryopreservati
6、on solution(冻存液)DMSO（二甲基亚砜）/甘油（高压灭菌） 1ml（10）胎牛血清 2ml（20）培养液 7ml（70）原代细胞培养骨髓细胞培养1、 高压手术器械及玻璃器皿：小弯剪（2）、小弯镊（2）、皮镊（1）、过滤网、离心管（4）、吸管（4）、小圆试管（4）、平皿（2）2、 方法器械盒等放入超净台，紫外灯消毒30分钟酒精灯烧试管、离心管等备用，平皿中加入L-DMEM10FCS处死或过量麻醉实验动物，浸泡于75酒精5分钟小心分离取双侧股骨，勿破坏骨髓腔，放入平皿中，剥离其他组织移入另一平皿，放入超净台，从中间剪断股骨，5ml注射器反复抽吸、吹洗经滤网过滤去除组织块，移入离心管8
7、00-1000转/分离心，3-5分钟，2次加培养基缓力吹打混匀细胞后，移至50ml培养瓶，37，5CO2培养MSC一般2天后换液，肿瘤细胞24h后换液细胞传代细胞长满80瓶壁后，消化传代1、 吸除原培养瓶中的培养液，用无血清培养基洗一次。2、 瓶内加入0.25trypsin0.02EDTA消化液（原代因细胞成分较杂，加EDTA较容易消化下来，传代后的细胞一般只用trypsin消化即可），平摇培养瓶，使消化液流过细胞表面，373-5分钟，显微镜下观察，发现细胞回缩，细胞间隙增大后，即可吸出消化液，移至离心管，加血清终止消化。3、 加了EDTA消化的细胞800r离心两次，3-5分/次，吸除上清。如
8、果只是用Trypsin消化的细胞只需离心一次。4、 加入L-DMEM10FCS 1ml重悬细胞，1:2-3分瓶培养。细胞冻存（缓存）1、0. 25trypsin（或0.02EDTA）消化5min左右，镜下见细胞回缩间隙增大，即可吹打脱落。3、 800r离心5分钟，2次（无EDTA，离心一次即可）4、 配制冻存液：甘油:血清:完全培养基=1:2:75、 50ml培养瓶的细胞（约5×105），用1ml冻存液重悬细胞，放入冻存管中。6、 冻存步骤：41h201h-801h- -196液氮冻存。（冻存细胞程序性降温，4放置时间40min以上，3h以内，20对细胞损伤最大，1h左右为宜。）细胞
9、复苏（速溶）冻存管直接投入37水浴，平摇直至融化，种于50ml培养瓶中。根据细胞贴壁情况换液（一般24-36h换液）。 肅莃莁蚇肄肃薇薃蚀膅荿葿虿芈薅螇螈羇莈蚃螈肀薃蕿螇膂莆薅螆莄腿袄螅肄蒄螀螄膆芇蚆螃艿蒃薂螂羈芅蒈袂肁蒁螆袁膃芄蚂袀芅葿蚈衿肅节薄袈膇薈蒀袇艿莀蝿袆罿薆蚅袆肁荿薁羅膄薄蒇羄芆莇螆羃羆膀螂羂膈蒅蚈羁芀芈薄羁羀蒃蒀羀肂芆螈罿膅蒂蚄肈芇芅薀肇羇蒀蒆肆聿芃袅肅芁薈螁肅莃莁蚇肄肃薇薃蚀膅荿葿虿芈薅螇螈羇莈蚃螈肀薃蕿螇膂莆薅螆莄腿袄螅肄蒄螀螄膆芇蚆螃艿蒃薂螂羈芅蒈袂肁蒁螆袁膃芄蚂袀芅葿蚈衿肅节薄袈膇薈蒀袇艿莀蝿袆罿薆蚅袆肁荿薁羅膄薄蒇羄芆莇螆羃羆膀螂羂膈蒅蚈羁芀芈薄羁羀蒃蒀羀肂芆螈罿膅蒂蚄肈芇芅薀肇羇蒀蒆肆聿芃袅肅芁薈螁肅莃莁蚇肄肃薇薃蚀膅荿葿虿芈薅螇螈羇莈蚃螈肀薃蕿螇膂莆薅螆莄腿袄螅肄蒄螀螄膆芇蚆螃艿蒃薂螂羈芅蒈袂肁蒁螆袁膃芄蚂袀芅葿蚈衿肅节薄袈膇薈蒀袇艿莀蝿袆罿薆蚅袆肁荿薁羅膄薄蒇羄芆莇螆羃羆膀螂羂膈蒅蚈羁芀芈薄羁羀蒃蒀羀肂芆螈罿膅蒂蚄肈芇芅薀肇羇蒀蒆肆聿芃袅肅芁薈螁肅莃莁蚇肄肃薇薃蚀膅荿葿虿芈薅螇螈羇莈蚃螈肀薃蕿螇膂莆薅螆莄腿袄螅肄蒄:4