恶性肿瘤非编码RNA相关蛋白的功能网络与调控机制的研究.docx

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1、项目名称：恶性肿瘤非编码 RNAf关蛋白的功能网络与调控机制的研究首席科学家:起止年限:依托部门:一、研究内容本项目拟解决的关键科学问题是“恶性月中瘤非编码RN储目关蛋白的功能网络 和调控机制及其与月中瘤发生发展和治疗抗性的关系”，包括以下四个方面：1）新 的月中瘤ncRNAK相关蛋白的发现和作用机制；2）月中瘤ncRNA专录、转运、加工 及修饰过程中相关蛋白的功能；3） ncRN仰目关蛋白在月中瘤发生发展中的作用；4） ncRNAlf关蛋白与月中瘤治疗抗性的关系。围绕上述科学问题，本项目拟以我国常见的恶性月中瘤为疾病模型，研究月中瘤细胞内相关蛋白网络如何参与 ncRNA勺生物合成与基因调控功

2、能，并探索它们之 间的相互作用对月中瘤细胞生物学行为的影响，以及与月中瘤发生发展和治疗抗性的 关系。主要研究内容包括：1）建立和优化适合于月中瘤研究的ncRNA组学方法和 ncRNAlf关蛋白研究体系，筛选和鉴定一批新的月中瘤相关ncRNAR具相互作用蛋 白；2）探索DNA甲基化和组蛋白修饰及转录因子对月中瘤 ncRNA勺转录调控，以 及相关蛋白在ncRNA专运、加工及修饰过程中的作用；3）探讨ncRNAS其相关 蛋白对月中瘤启动细胞自我增殖、分化方向和成瘤特性的调控机制，阐明其与月中瘤 发生的关系。研究ncRNAS其相关蛋白在月中瘤发展过程中对月中瘤细胞EMT月中瘤转移和血管生成的作用；4）

3、研究ncRNAS其相关蛋白调控月中瘤细胞凋亡、自噬 的机制，解析常见恶性月中瘤中ncRNAS其相关蛋白对治疗抗性的影响。二、预期目标本项目的总体目标以常见的恶性月中瘤为模型，通过研究非编码RNA(ncRNA相关蛋白的功能网络和调控机制，发现一批新的月中瘤ncRNAS相关蛋白并揭示其作用机制；阐明 月中瘤ncRNA专录、转运、加工及修饰过程中相关蛋白的功能； 解析ncRNAffi关蛋 白在月中瘤发生发展中的作用以及 ncRNAj目关蛋白与肿瘤治疗抗性的关系，使我国 在恶性月中瘤ncRNAj目关蛋白研究领域取得突破性进展，为我国在该领域培养一批 优秀人才。本项目的五年预期目标1 .建立适合于月中瘤

4、研究的ncRNAf目关蛋白的各种平台，包括适合于月中瘤研 究的ncRNAS学技术平台，月中瘤特异ncRNAf目互作用蛋白质高通量筛选和分析技 术平台；建立计算生物学和实验生物学有机结合的研究方法，系统分析和鉴定一批新的不同长度和不同类型月中瘤特异性 ncRNAR相关蛋白，揭示ncRNAS相关蛋 白的相互作用机制。2 .发现30-40个新的参与恶性月中瘤功能网络调节的 ncRNAf关蛋白，包括 参与月中瘤ncRNASH的DNA甲基化、组蛋白修饰和转录，以及月中瘤 ncRNA专运、 加工及成熟修饰的相关蛋白；调节月中瘤启动细胞自我增殖、多向分化，成瘤能力 等生物学特性的ncRNA®关蛋白

5、；调节月中瘤细胞EM不口抗凋亡特性，以及月中瘤转 移、血管生成和治疗抗性的ncRNAffi关蛋白，为阐明恶性月中瘤ncRNAf目关蛋白功 能网络和调控机制提供新线索。3 .阐明ncRN仰目关蛋白在月中瘤发生发展和治疗抗性中的新的调控机制，包括月中瘤特异ncRN仰目关蛋白的表观遗传调控机制，ncRN仰目关蛋白对月中瘤启动细 胞的调控机制，ncRNAg关蛋白对对月中瘤血管生成、以及月中瘤细胞迁移和EMT的调控机制，ncRNA®关蛋白对月中瘤细胞凋亡、自噬和治疗抗性的调控机制，深 入研究10-20种左右具有临床意义的非编码 RNAS相关蛋白，发现至少2 3条 新的ncRNAf目关蛋白参与的

6、调控月中瘤发生发展和治疗抗性的信号转导通路，为 人类认识月中瘤发生发展的分子机制和治疗癌症提供理论依据。4 .预计在SCI收录杂志发表论文80篇以上，其中IF>5分以上论文超过40 篇，争取在 Cell、Nature、Science等顶尖杂志上发表高水平论文，申请专利 10-15 个。5 .为我国在恶性月中瘤ncRN仰目关蛋白研究领域培养一批高水平创新性人才， 包括培养15-20名博士后等青年骨干人才，7080名博士生，100名硕士生，产 生百篇优秀博士论文1-2篇。三、研究方案1 .总体学术思路：以非编码RNA(ncRNA相关蛋白调控网络在月中瘤发生发展与治疗抗性中的作用研究作为总体目

7、标，本项目拟识别和鉴定一批月中瘤特异的ncRNA筛选并确定参与它们在月中瘤细胞中异常表达及行使生物学功能的相关蛋白质。此外，探索 ncRNA与相关蛋白之间的相互作用机制，及其对月中瘤细胞增殖、分化、转移、凋 亡和治疗抗性等的作用，最终阐明月中瘤非编码RNA®关蛋白调控网络系统及功能， 为人类认识肿瘤发生发展的分子机制和治疗癌症提供理论依据。总体研究方案图 示如下：技术途径及可行性：本项目在总体目标的架构下分为 4个主要的课题方向(见课题设谿)，各课 题方向的主要技术途径总结如下：课题1:利用RN创学研究方法，采用深度测序技术、DNW库、基因芯片技术，高通量筛选和鉴定新的月中瘤相关 n

8、cRNA采用基于生物质谱分析的蛋白质 组学技术、酵母三杂交技术、SELEX技术、免疫沉淀-RNA:随机聚合酶链反应方 法，以及 CLIP(crosslinking and immunoprecipitation) 方法、蛋白复合体分 离检测技术，结合生物信息学技术，规模化地系统性筛选、鉴定月中瘤特异性ncRNA 相互作用蛋白，发现ncRNAf蛋白质相互作用规律。课题2:通过DAC/TSA#理法结合MSPffi ChIP法，筛选、鉴定受表观遗传 调控的ncRNA通过DNA®和层析、ChIP-Seq、荧光素酶报告系统等方法在月中瘤 细胞中检测转录因子与启动子的结合活性；通过免疫共沉淀、酵

9、母三杂交、SELEX CLIP等技术分离和鉴定与ncRNA结合蛋白；用筛选调控转录后加工关键蛋白的 miRNA应用用免疫共沉淀方法鉴定 ncRNA多饰蛋白，如lin-28等和候选miRNA 前体的结合及体外催化实验鉴定恶性月中瘤细胞系中ncRNA修饰蛋白介导的候选miRNAltf体尿喀噬化；应用测序技术对 ncRNAS因多态性进行分析。课题3:通过ncRNA®片、ncRNA隆和深度测序鉴定月中瘤启动细胞特异的 ncRNAft达谱；通过生物信息学预测、蛋白组学、蛋白差异表达分析以及RNAf扰实验研究分离和鉴定ncRNAf目关蛋白；通过平皿培养、三维 Matrigel培养、 免疫缺陷鼠移

10、植瘤系统、ncRNAS达/拮抗实验研究ncRNA在月中瘤启动细胞中的 生物学功能。采用划痕修复试验、转移小室(Transwell )的细胞迁移和侵润检 测系统和荷瘤鼠转移模型等研究月中瘤转移能力；采用倒相性、荧光和共聚焦显微 技术观察月中瘤细胞形态；采用小动物成像系统技术，动物外周学循环月中瘤细胞检 测技术，组织学检测技术以及荧光定量PC叱术等检测ncRNAT预对恶性月中瘤转 移的作用；通过免疫组化和免疫细胞化学等检测转移细胞ncRNAffi关的蛋白通路激活状态。课题4:通过亲和层析法、酵母三杂交系统、ChIP-RT-PCRl?技术筛选和鉴定ncRNAffi关的凋亡蛋白；应用THF方法制备富勒

11、烯纳米颗粒；用动态光散射、透射电镜、HPLC等技术测定纳米颗粒的粒径、表面电势、浓度及分散度等理化性质；通过荧光观察 GFP-LC磔集，western检测LC3-I向LC3-II的转化，电子显微镜观察自噬体及自噬溶酶体， western检测p62和Free GFP等进行自噬 检测；通过检测细胞自噬特征性的 GFP-LC3点状聚集，筛选自噬相关ncRNA采 用Western Blotting,免疫组化以及酶活性检测等手段研究 ncRNAft成过程中的 重要蛋白质如 Drosha、Dicer以及Argonaute 2在细胞自噬过程中表达水平、分 子形式以及细胞内定位可能的变化。本研究团队中有相当部

12、分的研究人员具有多年从事月中瘤学或月中瘤学相关基 础研究的科研经验，其中在 Cell、Nature、Science、N Engl of Med系列杂志 上发表的文章中与月中瘤相关的占60%。各课题组建立了适合于月中瘤研究的 ncRNA 相关蛋白的实验平台和分析平台，包括上述绝大部分技术途径，建立了多种化学 致癌物诱导人体细胞恶性转化的模型，建立了月中瘤启动细胞的研究平台以及富集 月中瘤启动细胞的动物模型和细胞模型， 建立了多种月中瘤细胞抗性模型，这些均为 本研究奠定了坚实的基础，保证了该项目的顺利进行。2 .创新点与特色理论方面创新：(1)首次研究以ncRNA为核心的基因表达的蛋白质调控网络：

13、本研究从ncRNA与蛋白质的相互作用入手，全面系统地解析以ncRNA*纽带的蛋白质功能网络对 月中瘤的作用。一方面研究月中瘤细胞内调控ncRNA专录和加工的蛋白质功能，另一 方面研究ncRNA与其相关蛋白组成的调控网络调节着月中瘤细胞编码蛋白质的癌 基因和抑癌基因的表达，从而参与调节月中瘤细胞的多种生命现象。这一观点的提 出与论证将为完善一个多通路、多层次的基因调控网络以解析恶性月中瘤的发生和 发展机制奠定基础。(2)为恶性月中瘤的治疗提供新靶点：月中瘤的发生发展涉及多个编码基因的变异， 而细胞内源性的ncRNA蛋白质调控网络可调节多种基因的表达，因此，改项目 将为恶性月中瘤的治疗提供更稳定有

14、效的抗癌靶点。此外，月中瘤启动细胞是月中瘤发生、复发和转移的根源，对化疗和放疗不敏感。本项目通过筛选决定月中瘤启动细 胞分化和生长命运的ncRNA及其相关蛋白，不仅为治疗恶性月中瘤提供了新的靶 点，还提供了合适的靶细胞群，这将成为新一代的月中瘤基因治疗手段。(3)为研究ncRN片目关蛋白调控月中瘤提供新的模型：本项目将着眼于恶性月中瘤 内维持其生长的特殊细胞群一一月中瘤启动细胞，通过筛选、识别和鉴定参与调节 恶性月中瘤启动细胞基因表达的ncRN破其相关蛋白质，研究它们对月中瘤启动细胞 分化命运的调控作用，从而为 ncRNA蛋白质调控网络调节月中瘤发生发展的研究 提供了一个动态的崭新的生物学模型

15、。 此外，最新的研究发现月中瘤细胞自噬与治 疗抵抗有关，本研究通过分析自噬过程中ncRN绅目关蛋白的功能，阐述其对月中瘤 治疗抵抗的作用，为研究月中瘤治疗敏感性提供新模型。(4)在部分交叉研究领域进行首次研究：有关ncRN破其相关蛋白调控月中瘤治疗抗性的研究在国际上才刚刚展开，目前尚缺乏系统和深入的研究；此外，目前 文献中尚未有ncRNAj目关蛋白调控细胞自噬的报道，结合课题组温龙平教授团队 首次发现的纳米颗粒可以通过 ncRNAM控细胞自噬，为纳米生物学及纳米安全性 研究提供新线索。技术方法创新：(1) RNA&学平台在月中瘤特异ncRN颇选中应用：本研究将采用RNA&学方法

16、， 并结合深度测序和计算生物学方法，建立高通量筛选和鉴定ncRNAK术平台，将 有效地发现不同长度和类型的新的月中瘤特异的 ncRNA(2)月中瘤相关ncRNAffi互作用蛋白系统研究：本研究采用基于生物质谱分析的 蛋白质组学技术、酵母三杂交技术、SELEX技术、CLIP(crosslinking andimmunoprecipitation) 方法以及蛋白复合体分离检测技术等多种新技术新方法， 并有机结合计算生物学方法，理论与实验科学相结合，高通量和特异性相结合， 是一种新的ncRNAj目互作用蛋白研究策略。这也是国内首次开展大规模的月中瘤特 异的ncRNAR其相关蛋白的发现和作用机制研究3

17、.课题设谿1）课题设谿的思路本研究项目从发现和鉴定恶性月中瘤特异的非编码RNA（ncRNA）f其相关蛋白质出发，分别从ncRNA®节轴心的上的和下游研究ncRN用口相关蛋白的相互作用 及相互调控机制，并阐述ncRNAS其相关蛋白在月中瘤自然发生发展和治疗抵抗等 病理过程中的作用。课题的设谿围绕这一学术思路展开，分为4个分课题：（1）月中瘤ncRNAR具相互作用蛋白的系统识别与机制研究；（2）月中瘤ncRNA专录力口工 相关蛋白的功能研究；（3） ncRNAf关蛋白对月中瘤启动细胞和月中瘤转移的调控作 用，及其与月中瘤发生发展的关系；（4） ncRN仰目关蛋白质调控月中瘤细胞程序性死

18、亡以及治疗抗性的功能研究。课题一：月中瘤非编码RN破其相互作用蛋白的系统识别与机制研究1 .研究内容：1）筛选和鉴定新的月中瘤相关非编码 RNA以人常见月中瘤（肝癌、乳腺癌和食管癌等）细胞系和人癌组织及正常组织标本 为研究对象，建立和发展高通量ncRNAffi选和鉴定技术平台，针对不同的研究目 的采用多种不同途径获得月中瘤特异的 ncRN的子。具体技术途径可包括：（1）采 用RNAfi学研究方法，分离制备RNA采用罗氏454测序技术或Illumina Solexa 测序技术等方法，进行高通量测序分析和大规模筛选。（2）分离制备ncRN的子， 构建不同大小的 ncRNA勺 cDNACt库（siz

19、e-fractioned RNA library）（包括我们建立非编码小分子RNA®库技术，FEBS lett.2005,579: 3849-3854）和消减文库，对文库进行大规模筛选和高通量测序分析。（3）采用Invitrogen公司最新 推出的为检测长ncRNAS计的NCodeNoncoding RNAArray （包含17112个人ncRNA 分子）获得月中瘤特异的长度大于200bp的候选ncRNA子；采用miRNA®片分析， 获得肿瘤特异的候选miRNA子。针对获得的新数据和已有数据，结合生物信息 学方法高通量发现新的不同长度和类型的 ncRNA子，获得常见月中瘤n

20、cRNAS达 谱，筛选差异表达ncRNA获得常见月中瘤特异表达的候选 ncRN的子。针对获得的月中瘤特异的候选ncRNAib子，采用Northern blot、原位杂交和 /或实时定量PCR?技术对大样本月中瘤和正常组织标本及癌细胞系进行进一步鉴定分析，最终获得月中瘤(肝癌、乳腺癌和食管癌等)ncRNA表达谱和特异表达 ncRNA2)系统分析和鉴定月中瘤特异非编码 RNA勺相互作用蛋白质建立和完善规模化的月中瘤特异 ncRNA相互作用蛋白质发现、筛选和分析的 规范化技术体系，获得一批与肿瘤特异ncRNA®互作用蛋白质分子。针对获得的 月中瘤特异ncRNA分子，采用基于生物质谱分析的蛋

21、白质组学技术、筛选和鉴定 RNA与蛋白质相互作用的酵母三杂交技术、SELEX(systematic evolution ofLigands by exponential enrichment) 技术、免疫沉淀-RNA:随机聚合酶链反应 方法，以及 CLIP(crosslinking and immunoprecipitation) 方法、蛋白复合体 分离检测技术，结合生物信息学技术，筛选、鉴定月中瘤特异性ncRN仰目互作用候 选蛋白质。经月中瘤细胞内外验证，获得一批月中瘤ncRNA®互作用蛋白质分子，为 ncRNAf目关蛋白的生物学功能研究提供保证。miRNA目前哺乳动物细月fi研究

22、最成熟的 ncRNA在分析和鉴定miRNAfi?基 因蛋白方面，本项目研究人员中山大学生科院的蒋嵩山副教授前期的研究构建了 600多个人miRNAS因的慢病毒表达载体和质粒表达载体，通过内源性提高miRNA 的表达，并进行蛋白质组学分析，系统地筛查肿瘤相关miRNA勺靶基因。结合通 过同位素标记氨基酸的SILAC方法，可获得相关度非常高的 miRNA靶蛋白调节 关系。在生物信息学软件预测的参考下，通过荧光素酶报告系统对miRNA靶蛋白调节关系进行鉴定，最终系统地获得月中瘤相关 miRNA勺调节谱，作为后续研究 的基础。3)月中瘤特异非编码RNAW相互作用蛋白的作用机制阐明ncRNAW蛋白质相互

23、作用的序列和结构规律对揭示 ncRNAW相互作用蛋 白质分子的作用机制具有重要意义。 首先针对获得的ncRNA®互作用蛋白质，采 用计算生物学方法，以实验证实的ncRNAW蛋白相互作用为基础，开展基于机器 学习的ncRNAW蛋白相互作用研究。探讨三个问题：与某一特定蛋白结合的若 干RNA勺结合区特征识别；与某一特定类型RNAg合的若干蛋白的结合区特征 识别；开展基于机器学习的ncRNAf蛋白相互作用的预测研究，构建分类模型， 预测与某一特定 ncRNA结合的所有可能蛋白或与某一蛋白结合的所有可能 ncRNA最终为实验提供计算生物学支持。结合计算生物学的分析结果，对获得的月中瘤特异的n

24、cRN肪子进行碱基或序列片段进行替换、缺失，采用规模化研究 蛋白质与RNAf互作用技术在细胞内外探索ncRNAf蛋白质相互作用，揭示蛋白 质-ncRNA的相互作用方式，进而发现 ncRNA与蛋白质相互作用的序列和结构规 律，为基础和应用研究提供条件。4）月中瘤特异非编码RNA®互作用蛋白在月中瘤中的定性、定量和定位研究针对获得的月中瘤特异ncRNAR具相互作用蛋白质，对各种常见月中瘤标本进行 定性、定量和细胞定位分析，揭示其在月中瘤中表达的动态时空关系。应用Northern Blot、实时定量RT-PCRJ术和原位杂交等原位技术对月中瘤相关 ncRNA 的表达进行定位和定性研究，以确

25、认月中瘤相关ncRNAR其相关的靶基因蛋白在恶 性月中瘤中的上调/下调关系。应用 Western Blot和免疫组织化学技术，对月中瘤相 关ncRNAffi关蛋白在恶性月中瘤中的表达进行定量或半定量检测。结合表达谱筛选 数据，对月中瘤相关ncRNAR相互作用蛋白白角色即癌基因/抑癌基因进行确认， 并与功能研究衔接。2 .研究目标：1）建立月中瘤非编码RNAf目互作用蛋白质高通量筛选和分析技术平台。2）系统分析和鉴定一批新的不同长度和不同类型月中瘤特异性非编码RNAR相关蛋白，揭示非编码RNAR相关蛋白的相互作用机制。承担单位：军事医学科学院课题负责人：郑晓飞研究员经费比例：23.71%课题二：

26、月中瘤非编码RNA专录加工相关蛋白的功能研究1 .研究内容：1）月中瘤ncRNAg达的表观遗传调控DNAP基化和组蛋白修饰是ncRNAfe观遗传学调控的主要形式，ncRNAd句的 表达调控也属于表观遗传学调控的范畴。首先通过分析月中瘤表观遗传学改变与ncRN展达谱之间的关系获得候选的表观遗传学调控的ncRNA然后验证ncRNAg达和启动子区域DNAP基化的对应关系，并比较DNAP基化酶才制剂（DAC处理 前后相关ncRNA勺表达情况，确认ncRN展达受DNAP基化调控。应用抗活性乙酰 化（acetyl-H3K9） 和甲基化组蛋白抗体（dimethyl-H3K4、H3K36特异识别处于 活化状态

27、的染色质；同时应用抗失活染色质的甲基化组蛋白抗体（trimethyl-H3K9 、H4K2Mtrimethyl-H3K27）进行染色质免疫沉淀分析；结合 TSA 处理前后ncRNA勺表达与组蛋白修饰状态以明确组蛋白修饰对 ncRNA勺调控作用。 ncRN整身也可通过与甲基化相关蛋白的相互作用进而调控其它基因和ncRNA勺表达。本研究还将通过分析月中瘤相关ncRNA勺表达与DNMTS性的关系筛选出调控 DNMTS候选ncRNA并对其蛋白调控网络进行分析。2）月中瘤ncRNA专录因子的识别与功能鉴定为了识别和鉴定月中瘤ncRNA勺转录因子，本课题首先应用ncRNA0动子区域 作为诱饵从蛋白库中筛选

28、出与其特异结合的蛋白质，并通过功能实验探讨该蛋白对月中瘤ncRNA专录的影响，并进一步鉴定该转录因子所调控的 ncRNA专录谱。另 一方面，应用ChIP-Seq方法在月中瘤细胞中检测并筛选与已知的月中瘤相关转录因 子，如c-myc、p53等相结合的ncRNA8因启动子区域，以获得月中瘤相关转录因 子的ncRNA8因启动子结合谱。3）月中瘤ncRNA熟加工的机制ncRNA在转录后至成熟过程中，需经过多种蛋白和酶类的调控，我们将在月中 瘤模型中研究ncRNA专录后加工相关蛋白的表达情况、并分析过度表达或敲低后 对月中瘤相关ncRNAft达谱的影响。通过免疫共沉淀、酵母三杂交、SELEX CLIP等

29、技术分离和鉴定此过程中的调控蛋白并研究其功能。我们也将选择与各类ncRN峨熟加工相关的蛋白分子（如与miRNAfi口工相关 的Drosha、Dicer及Argonaute 2等），将其基因的3' -UTR克隆至双荧光素酶 报告系统，采用课题组1创建的miRNAS达库在全基因组范围内系统地筛选可能 调控这些蛋白的miRNA并结合课题1中所鉴定的常见恶性月中瘤特异性 ncRNAft 达谱，通过两者交集探讨恶性月中瘤特异性 miRNA寸ncRNAfi转录后至成熟过程的 负反馈调控网络。4）月中瘤成熟ncRNA常修饰的机制近期研究发现，ncRNAE代谢过程中被异常修饰将会导致其降解，从而影响

30、细胞内成熟ncRNA勺水平。例如lin28通过调节let-7前体尿喀噬化介导的let-7 前体降解。因此，本课题将识别和鉴定一批异常修饰月中瘤相关ncRN的导致其表达改变的蛋白质，并探讨其作用机制。在月中瘤标本中分析从课题1中筛选、鉴定的ncRNA1关蛋白与ncRNA1达水平的相关性。通过在月中瘤细胞系中过度表达或用 RNA方法沉默该候选蛋白的表达，观察不同成熟阶段的相关 ncRNA勺表达变化。 进一步通过 CLIP（crosslinking and immunoprecipitation）方法和体外催化实验 鉴定相关蛋白与ncRNA勺结合以及对其修饰的方式。止匕外，ncRNA勺序列多态性也是

31、影响其成熟加工的重要因素。本课题将应用 测序技术对ncRNA!因多态性进行分析，明确SNP对月中瘤相关ncRNA熟加工的 影响。2 .研究目标：1）明确月中瘤ncRNA表达的表观遗传调控机制及相关蛋白（酶）在 ncRNA蛋 白调控网路中的作用。2）分离和鉴定一批新的调控月中瘤相关 ncRNA勺转录因子，并揭示其在ncRNA- 蛋白调控网路中的作用。3）获得一批月中瘤ncRNA加工成成熟过程及成熟后异常修饰相关的蛋白并阐 明其功能。承担单位：中国人民解放军总医院课题负责人：郭明洲研究员经费比例：22.12%课题三、非编码RNA相关蛋白对月中瘤启动细胞和月中瘤转移的调控及其与月中瘤发 生发展的关系

32、1） 研究内容：1）完成月中瘤启动细胞的ncRNAR相关蛋白表达谱月中瘤启动细胞在月中瘤组织内数量稀少，是制约其高通量分子表达谱研究的瓶颈，课题组前期研究建立了高效的月中瘤启动细胞筛选富集体系，即通过低剂量化疗选择压力，在荷瘤鼠中选择出具有高比例月中瘤启动细胞的月中瘤细胞株。该研究体系可以推广到其他恶性实体瘤，以获得足够数量的肿瘤启动细胞供本研究 所用。我们将（1）以各类常见恶性月中瘤的启动细胞作为材料，采用不同大小的 ncRNA勺cDNAt库（size-fractioned RNA library ）和月中瘤启动细胞体外球囊 培养扩增等策略构建各种月中瘤启动细胞专一性的小分子ncRNA勺cD

33、NAt库。对文库进行大规模筛选和序列测定分析，预期可发现一批月中瘤启动细胞特异的 ncRNA （2）结合ncRNAK片及克隆测序技术，分析比较月中瘤启动细胞和相应的 非启动癌细胞中ncRNAft达谱的差异，以及月中瘤启动细胞在向上皮型和间质型成 熟癌细胞分化过程中ncRNAft达谱的变化，发现和鉴定月中瘤启动细胞特异表达的 新ncRNA在此基础上，我们将在原发恶性月中瘤组织中分离原代的月中瘤启动细胞， 通过Northern杂交法鉴定新发现的专一 ncRNAg达，通过实时PCR寸其定量， 再通过原位杂交对其定位。（3）通过计算机预测系统和蛋白组学技术分析和鉴定 ncRNA®关的蛋白谱，

34、并鉴定ncRN仰目关蛋白质在各类原代月中瘤启动细胞的表达 及其与ncRNAg达的相关性。2） ncRNAffi关蛋白对月中瘤启动细胞的调控作用通过前期研究所建立的一系列月中瘤启动细胞研究模型，分析ncRNA-g白质调控网络对月中瘤启动细胞生物学特性， 包括自我增殖能力、多向分化的潜能和体 内成瘤能力的调控作用。（1）自我增殖是月中瘤启动细胞赖以维持自我的主要特征， 也是恶性月中瘤发生和发展的源泉。无血清培养条件下，月中瘤启动细胞在悬浮状态 下形成细胞球囊（sphere）,球囊形成率反映细胞自我增殖的能力。我们将进行 专一性的ncRNA=F预，然后分析月中瘤启动细胞球囊形成率，并通过蛋白差异表达

35、 分析以及相关RNAf扰实当明确ncRNAS关蛋白与月中瘤启动细胞球囊形成和自我 增殖能力的关系。（2）采用二维平皿及三维 Matrigel培养和免疫缺陷鼠体内种 植等研究体系，并利用上皮细胞和间叶细胞的表面标记物，进一步明确目标 ncRNA寸月中瘤启动细胞分化方向的影响。（3）检测过表达或沉默ncRNAt月中瘤启 动细胞成瘤能力的变化，并分析 ncRNA相关蛋白的调控网络，以阐明 ncRNA蛋 白调控网络与月中瘤发生的关系。3） ncRNAffi关蛋白对月中瘤转移的作用在课题1识别和鉴定肿瘤特异ncRN"口相关蛋白特异表达谱的基础上，我们 将进一步筛选鉴定与月中瘤细胞转移密切相关的

36、ncRNAR其相关蛋白，在体外和体内模型中研究这些ncRNA及其相关蛋白质对月中瘤细胞转移特性的调节作用与机 制。首先，我们在月中瘤细胞中转导目标ncRNA勺表达序列或者其拮抗序列，然后： 采用划痕修复和转移小室(Transwell )技术检测ncRNA=F预对月中瘤细胞迁移 (Migration )和侵袭(Invasion )的作用，并分析相关蛋白通路的激活状态；采用倒相性、荧光和共聚焦显微技术，以及 Matrigel细胞三维培养系统观察 ncRNA=F预对月中瘤细胞EM呢状的作用，并鉴定调节EMT勺蛋白信号分子的激活 状态；在免疫缺陷鼠肾包膜或皮下种植以及鼠尾静脉注射肿瘤细胞， 采用活体

37、成像技术，组织病理学检测以及荧光定量 PCR?技术检测ncRNA寸恶性月中瘤转移 的调控作用，同时，通过免疫组化和免疫荧光等检测转移细胞 ncRN仰目关的蛋白 通路激活状态。4） ncRNAffi关蛋白对月中瘤血管生成的调控作用月中瘤血管生成是恶性月中瘤发展过程的重要事件，研究证实月中瘤细胞可以 通过分泌促血管生成因子，诱导血管内皮细胞向月中瘤组织迁移并增殖， 也可以诱 导组织内多能干细胞分化为血管内皮细胞。最近的研究还发现，月中瘤启动细胞也可向血管样内皮的方向分化，形成月中瘤的新生血管。因此，本课题中我们将探索 在恶性月中瘤的微环境中ncRNA相关蛋白质调控网络对血管内皮细胞的增殖、分 化与

38、迁移的调控作用，及其与月中瘤血管生成的关系。具体研究内容包括：基于 课题1所建立的ncRNAt其相关蛋白的检测平台，在与月中瘤细胞共培养的模型里， 分析正常组织干细胞向血管内皮细胞分化过程中，以及血管内皮细胞增殖过程中ncRNA及其相关蛋白的时空变化规律，筛选出与血管内皮增殖和分化相关的 ncRNAR其相关蛋白；通过在血管内皮细胞以及正常组织干细胞转导ncRNAft达序列或其拮抗序列，分析上述筛选的ncRNAR其相关蛋白对月中瘤细胞所诱导的 血管内皮细胞增殖、分化和迁移的作用；在月中瘤启动细胞向血管样内皮细胞分 化的模型中，通过转导上述筛选的ncRNAft达序列或拮抗序列，分析其调控作用。 2

39、.研究目标：1)完成月中瘤启动细胞的ncRNAS相关蛋白表达谱2)揭示ncRNAf关蛋白对月中瘤启动细胞的调控机制及其与月中瘤发生的关系3)阐明ncRNAf关蛋白对月中瘤血管生成、侵袭、转移和EMT专化的调控机制承担单位：中山大学 课题负责人：宋尔卫教授 经费比例：30.46%课题四：非编码RNA相关蛋白质调控月中瘤细胞程序性死亡以及治疗抗性的功能 研究1 .研究内容：1) ncRNAf关蛋白在月中瘤细胞凋亡中的功能研究利用课题1中系统筛选和鉴定所得到的与细胞凋亡相关的ncRNA在细胞及动物整体水平上揭示这些ncRN厮调控的靶蛋白参与细胞凋亡的传导通路，并阐 明这些ncRN传目关蛋白影响月中瘤

40、发生发展的分子机理。在此基础上，我们将从调控细胞凋亡的关键蛋白入手，针对性地选择在凋亡过程中起关键作用的(masterregulator )促凋亡或抗凋亡调控蛋白(例如p53、E2F1、Puma Bax、Bcl-2、Bcl-xL等)，将这些基因的3' -UTR克隆表达，然后利用课题1创建的miRNAg 达库来系统筛选影响凋亡/抗凋亡的新的ncRNA我们还将利用IP-ChIP和酵母 三杂交系统寻找与这些3' -UTR相结合的蛋白，进一步探索这些与3' -UTR相互 作用的新的ncRNAF口新的蛋白(novel proteins)是如何通过调控细胞凋亡或抗凋 亡来影响月中瘤

41、的发生发展。miR-17-92 cluster是目前公认的第一个非编码癌基因( Noncodingoncogene, OncomiR-1)，它在许多月中瘤中都呈现高表达。Mir-17-92本身是受Myc 正调控，但它又能正向调控 E2F1、PTENW及Bim等众多由它们介导的月中瘤调控 网络通路；Mir-17-92同时还受到hnRNPA的成熟加工的调控，因此，miR-17-92 是研究ncRNAW亡网络的典范。我们初步的研究证实：B23通过与hnRNPA和互作用调控mir-17-92的在细胞内的水平。因此，我们将以mir-17-92的研究为切 入点，探索它参与细胞凋亡和月中瘤发生的复杂的分子调

42、控机理。2) ncRNAffi关蛋白在月中瘤细胞自噬中的功能研究以我们已构建的稳定表达 GFP-LC3®白的孚L腺癌和HeLa癌细胞系为实验系统,利用课题1创建的ncRNA羡达库，筛选出能诱导或抑制癌细胞自噬的 ncRNA 然后鉴定这些ncRNA勺靶蛋白及其调控细胞自噬的分子机理； 针对性地选择一些 已知在细胞自噬过程中起着关键调控作用的关键蛋白质如Beclin-1和ATG5筛选能调控这些蛋白质表达水平的 ncRNA并验证所得到的ncRNAt细胞自噬过程 中的功能；探讨ncRNA成过程中的重要蛋白质如 Drosha、Dicer以及Argonaute 2在细胞自噬过程中表达水平、分子形

43、式以及细胞内定位可能的变化；在现有工 作基础上进一步确认ncRNAR相关蛋白在纳米颗粒引发的癌细胞自噬中的变化， 并通过过表达和Knock-down等手段揭示这些ncRNAK相关蛋白在细胞自噬中所 起的作用。3) ncRNAffi关蛋白在月中瘤治疗抗性中的功能研究(1)月中瘤治疗抗性相关模型建立与组织样本的收集：建立一系列针对各类月中瘤治疗产生抵抗作用的月中瘤治疗抗性模型，包括对化疗、放疗、内分泌治疗和靶 点药物治疗的抗性模型；收集在术后经历了不同种类的辅助治疗的病人的样本 并制作组织芯片，同时收集病人的临床治疗和完成5年随访工作。(2)月中瘤治疗抗性相关ncRNA勺筛选和鉴定：一方面运用月中

44、瘤治疗抗性相关模型和课题1建立的方案分离和构建不同大小的 ncRNAt库(size-fractionedRNAlibrary)和消减文库，运用Illumina Solexa测序技术等方法对文库进行大规模 筛选和高通量测序分析，结合生物信息学方法高通量发现新的 ncRN6子以及筛 选差异表达ncRNA获得月中瘤治疗抗性特异表达的候选 ncRN吩子。在前期课题 组各团队收集的月中瘤患者标本中，通过实时定量RT-PCRW原位杂交等研究所筛选的ncRNAS达。另一方面，从与月中瘤治疗抗性相关的蛋白质入手， 选择对各种 治疗抗性起重要调控作用的因子(如 HER2 ERa , Met、EGF畤)及其相关的

45、信 号传导通路中的关键分子(如 ATM CHK-1,2, BRCA1 Akt, MPAKft族等),通 过系统地克隆其3' UTR并利用已经创建的ncRNA表达库来系统筛选并鉴定与 上述因子关联的新的ncRNA(3)月中瘤治疗抗性相关ncRNAf关蛋白的筛选和鉴定：利用前期构建的ncRNA的慢病毒表达载体库，通过瞬时提高或沉默内源性特定ncRNA的表达，并进行SILAC定量蛋白组分析，系统地筛查月中瘤相关 ncRNA勺靶蛋白；利用SELEX亲 和层析富集和纯化以及酵母三杂交系统等技术发现和鉴定此抗性过程中与这些3-UTR相结合的蛋白，从而进一步探索月中瘤抗性中 ncRNAf关蛋白的调控

46、网络。 通过Western Blot和免疫组化等研究ncRNAffi关蛋白的表达。（4）月中瘤治疗抗性相关ncRNAffi关蛋白的功能研究：运用细胞生存和凋亡检测 研究ncRNA相关蛋白在过表达或者表达沉默的状态下月中瘤细胞对治疗药物的敏 感性；进一步揭示ncRN仰目关蛋白调控治疗抗性的相关信号传导通路 2.研究目标：1）阐明非编码RN绅目关蛋白在月中瘤细胞凋亡和自噬过程中的分子调控机理。 2）揭示非编码RN绅目关蛋白在治疗抗性中的作用机制和信号传导通路。承担单位：中国科学技术大学 课题负责人：吴缅教授经费比例：23.71%4.课题间相互关系本项目设谿的4个课题分别从功能和机制两个角度探索肿瘤

47、特异 ncRN传目关 蛋白在恶性月中瘤自然发生发展和治疗抗性中所扮演的角色。 课题1为其它课题提 供筛选与鉴定平台，拟发现一批肿瘤相关ncRNAf相关蛋白。在此基础上，课题 2则沿ncRNA相关蛋白轴心向上游鉴定月中瘤细胞内调控 ncRNAfe达的蛋白质及其 功能，而课题3与4则分别从月中瘤发生发展和治疗抗性两个方面研究 ncRNA相 关蛋白轴心下游的功能网络。四个课题是预期目标的四个有机组成部分， 其相互 关系如下图所示：上游：调控机制课题2:调控肿瘤ncRNA 转录和加工修饰的相关 蛋白质功能课题3:调控肿 瘤发生发展的 ncRNA相关蛋 白功能课题设谿与项目总体目标的关系针对本项目的总体

48、目标，课题1将系统地发现一批新的月中瘤ncRNAU目关蛋 白；课题2将阐明月中瘤ncRNA专录、转运、加工及修饰过程中相关蛋白的功能； 课题3及课题4将具体、深入地解析个别具有临床意义的 ncRNAR其相关蛋白在 月中瘤发生发展中的作用以及ncRN仰目关蛋白与月中瘤治疗抗性的关系。课题设谿与本项目的五年预期目标的关系1 .课题1将建立适合于月中瘤研究的ncRNAlf关蛋白的各种平台，包括适合于 月中瘤研究的ncRNAfi学技术平台，月中瘤特异ncRNASZL作用蛋白质高通量筛选和 分析技术平台；建立计算生物学和实验生物学有机结合的研究方法，系统分析和鉴定一批新的不同长度和不同类型月中瘤特异性ncRNA及相关蛋白，揭示ncRNA及相关蛋白的相互作用机制。2 .课题2、3、4预计将发现30-40个新的参与恶性月中瘤功能网络调节的 ncRNA 相关蛋白，包括参与月中瘤ncRNA!因的DNA?基化、组蛋白修饰和转录，以及月中 瘤ncRNA专运、加工及成熟修饰的相关蛋白；调节月中瘤启动细胞自我增殖、多向 分化，成瘤能力等生物学特性的ncRNAf关蛋白；调节月中瘤细胞EM不口抗凋亡特 性，以及月中瘤转移、血管生成和治疗抗性的 ncRNAf目关蛋白，为阐明恶性月中瘤 ncRN刖关蛋白功能网络和调控机制提供新线索。3 .课题2、3