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1、紫外分光光度法测定蛋白质含量一、实验目的1、 学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；2、 掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术；3、掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器 的主要构造。二、实验原理紫外-可见吸收光谱法又称紫外-可见分光光度法，它是研究分子 吸收190nmi-750nm波长范围内的吸收光谱，是以溶液中物质分子对 光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。紫外-可见吸收 光谱的产生是由于分子的外层价电子跃迁的结果，其吸收光谱为分子光谱，是带光谱。进行定性：利用紫外-可见吸收光谱法进行定性分析一般采用光 谱比较法。即将未知纯化合物的吸收光谱特征，如吸
2、收峰的数目、位 置、相对强度以及吸收峰的形状与已知纯化合物的吸收光谱进行比 较。定量分析：紫外-可见吸收光谱法进行定量分析的依据是朗伯 - 比尔定律：A=lgI0/I= ebc,当入射光波长入及光程b 一定时，在一 定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比，即物 质在一定波长处的吸光度与它的浓度成线形关系。 因此，通过测定溶 液对一定波长入射光的吸光度，就可求出溶液中物质浓度和含量。由于最大吸收波长入max处的摩尔吸收系数最大，通常都是测量入max 的吸光度，以获得最大灵敏度。光度分析时，分别将空白溶液和待测溶液装入厚度为 b的两个吸 收池中，让一束一定波长的平行单色光非别照射空
3、白和待测溶液， 以 通过空白溶液的透光强度为I0 ,通过待测溶液的透光强度为I ,根据 上式，由仪器直接给出I0与I之比的对数值即吸光度。紫外-可见分光光度计：紫外-可见吸收光谱法所采用的仪器称为 分光光度计，它的主要部件有五个部分组成，即光源»单色dI吸收池-检测普I»信号显示指由光源发出的复合光经过单色器分光后即可获得任一所需波长的平 行单色光，该单色光通过样品池静样品溶液吸收后，通过光照到光电 管或光电倍增管等检测器上产生光电流， 产生的光电流由信号显示器 直接读出吸光度 A。可见光区采用鸨灯光源、玻璃吸收池；紫外光区 采用笊灯光源、石英吸收池。本实验采用紫外分光光度
4、法测定蛋白质含量的实验原理：(1)蛋白质可作定量分析的原因：蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的 苯环含有共钝双键，所以蛋白质溶液在 275 280nm具有一个吸收紫外 吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光 度与其浓度成正比，服从朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。该法 测定蛋白质的浓度范围为0.1 1.0mg/mL。(2)此种方法测量的准确度差一点的原因：由于不同蛋白质中酪氨 酸和色氨酸的含量不同，所处的微环境也不同，所以不同蛋白质溶液 在280nm的光吸收职也不同。据初步统计，浓度为1.0 mg/mLW 1800 种蛋白质及蛋白质亚基在280nm的吸光度在0.33.0之间，平
5、均值 为1.25+/-0.51。所以此种方法测量的准确度差一点。(3)有喋吟、喀咤等核酸类干扰时的经验公式：若样品中含有喋吟、 喀咤等核酸类吸收紫外光的物质，在 280nm处来测量蛋白质含量时， 会有较大的干扰。核酸在260nm处的光吸收比280nm更强，但蛋白质 却恰恰相反，因此可利用280nm及260nm的吸收差来计算蛋白质的含 量。常用下列经验公式计算：蛋白质浓度(mg/mL =1.45A280-0.74A260(A280和A260分别为蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度 值)还可以通过下述经验公式直接计算出溶液中的蛋白质的含量：蛋白质浓度(mg/mL =F* A280*D
6、*1/d其中A280为蛋白质溶液在280nm处测得的吸光度值；d为石英比色 皿的厚度(cm) ；D为溶液的稀释倍数；F为校正因子(4)稀溶液中蛋白质浓度测定的经验公式：蛋白质的肽键在200250nm有强的紫外吸收。其光吸收强度在一定范围与浓度成正比，其 波长越短，光吸收越强。若选用215nm可减少干扰及光散射，用215nm 和225nm光吸收差值与单一波长测定相比，可减少非蛋白质成分引起 的误差，因此，对稀溶液中蛋白质浓度测定，可选用215nm口 225nm光吸收差法。常用下列经验公式：蛋白质浓度(mg/mL =0.144 (A215-A225)(A215和A225分别为蛋白质溶液在215nn
7、#口 225nm处测得的吸光度值）三、仪器与试剂仪器：TU-1901紫外-可见分光光度计，比色管（10ml的5个），吸量 管。试剂：标准蛋白质溶液：3.00 mg/mL溶液、0.9% NaCl溶液，待测蛋 白质溶液。四、实验步骤一准备工作1 .启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪 器。2 .在工作界面上选择测量项目（光谱扫描，光度测量），本实验选 择光度测量，设置测量条件（测量波长等）。3 . 将空白放入测量池中，点击START3描空白，点击ZEROK零。4 .标准曲线的制作。二测量工作1 .吸收曲线的绘制：用吸量管吸取2mL3.00mg/mL标准蛋白质溶液于10mL比色管中，用
8、0.9% NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1cm石英比色皿，以0.9% NaCl溶液为 参比，在190 nm-400nm区间，测量吸光度。2 .标准曲线的制作：用吸量管分别吸取 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL 3.00 mg.mL标准蛋白质溶液于 5只10 mL比色管中，用0.9% NaCl 溶液稀释至刻度，摇匀。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比，在280 nm处分别测定各标准溶液的吸光度 A278记录所得读数。3 .样品测定：取适量浓度的待测蛋白质溶液 3 mL,用0.9% NaCl溶 液稀释至刻度，摇匀，按上述方法测定 278nm处的吸光度。平行测定三份。五、
9、数据处理：1 .以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸收曲线，找出最大吸收 波长。由吸收曲线可得最大吸收波长 入max=278nm2 .以标准蛋白质溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。标准溶液浓度C (mg/mL吸光度Abs0.30.1850.450.2810.60.3930.750.4760.90.5840.7000.6y = 0.662x - 0.0134R2= 0.99850.5000.4000.300Abs线性(Abs)0.2000.1000.00000.20.40.60.8待测蛋白质的吸光度序号吸光度浓度 C (mg/mL10.4160.6486420.4130.64410
10、930.4040.630514平均浓度=0.641088 mg/mLSD= 0.009434RSD= 1.4715%当置信度为 P=95% ,f=2, t 0.95,2=4.3置 信区间 - f + tOM2x4 =0.641088 + 4.3 X 0.009434/ V 拥3=(0.641088 0.0234209) mg/mL在误差允许的范围内，蛋白质的含量为0.641088mg/mL六、思考题紫外分光光度法测定蛋白质含量的方法有何优缺点？受哪些因素的影响和限制？答：优点：方法操作简便、迅速、不需要复杂和昂贵的设备，不消耗 样品，测定后仍能回收利用，低浓度的盐和大多数缓冲溶液不干扰测 定。
11、缺点：准确度和灵敏度差一点。干扰物质多；对于测定那些与标准蛋 白质中铭氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。若样 品中含有喋吟、喀咤等吸收紫外光的物质，会产生较大干扰 干扰因素：主要受溶剂的影响。七，实验总结与反思。相比于上一个邻二氮菲分光光度法测定微量铁的实验来说，这个实验的操作步骤是相当的简单，出错的几率也小。最后测出样品的吸光度 要比另一组的大的原因，我想可能是标准蛋白质溶液的问题， 我们两 个小组用的不是一个容量瓶中的标准蛋白质溶液， 他们组使用的是新 配置的，我们小组使用的是之前遗留下来的，而且只剩下一点点，但 是足够我们做这次实验的量，我想很有可能是蛋白质沉积在了底部， 每次使用前没有轻轻的混合均匀，导致底部浓度偏大，最后就影响到 了我们待测溶液的浓度的测定。