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1、聚丙烯酰胺凝胶电泳上海交通大学医学院Polyacrylamide Gel Electrophoresis , PAGE李莉http：/www. shsmu. L掌握（不连续）PAGE的原理2.掌握影响PAGE迁移率的因素3,掌握PAGE的操作注意点、试剂作用4.熟悉PAG的聚合上海交通大学医学院名词解释L凝胶总浓度 2.交联度问答题上海交通大学医学院1 .与CAME相比，PAGE有哪些特点.3.简述不连续PAGE的原理。2 .试比较CAME与PAGE操作的区别。讲课内容PAG的组成PAG的浓度与孔径的关系尸_不连续PAgEPAGE的特点Acr + Bisf porous matrixclcct
2、rophorosis上海交通大学医学院一、PAG的组成PAG是由丙烯酰胺(acrylamide, Acr )单体和N, N亚甲双丙烯酰胺(N, N, N -methylene bisacrylamide, Bis )交联剂通过自由基(free radicals)聚合而成的一种多孔三维网状结构。上海交通大学医学院( 1 )丙烯酰胺(acrylamide, Acr )结构式CH2=CHCNH0(2)亚甲双丙烯酰胺(N,N, N', N-methylene bisacrylamide. Bis)-卤-产-1RAG的组成23讲课内容I PAg的聚合PAG的浓度与孔径的关系%上海交通大学医学院H
3、 M M H H i二、PAG的聚合polymerization of PAG需要催化剂(catalyzer)氧化还原系统作用，使Acr单体带有游离基(Free radicals ),从而与Bis进行聚合（一）化学聚合：APTEMED系统过硫酸胺(NH4) 2S2O8 ( Ammonium persulfate, AP )作为 催化剂，四甲基乙二胺(-N,N, N，N，- tetramethylethylene diamine , TEMED)为加速剂.上海交通大学医学院Th« Pogtrflf Ml” 1£AE在水溶液中能产生游离基SCV、使丙烯酰 胺单体的双键打开，活化
4、形成自由基丙烯 酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合形 成凝胶TEMED的游离碱基能促进AP形成SO注意.1TBMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条件下聚合宗分子氧存在，聚合不完全,绝氧,升高温度能提高聚合,（二）光聚合：核黄素-TEMED系统有痕迹氧存在下，核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或紫外光）分解，其黄素部分被还原 成无色型，但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶.注意:分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光 聚合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导式在 孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离一：蹄褪上海交通大学医学院.
5、PA6的组成三、PAG的浓度与孔径的关系the initial concentrations of acrylamide and BIS control the hardness and degree of crosslinking of the gel.PAG孔径的大小主要由Acr和Bis这两种物质的浓度决定,可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的单体浓度.Acr/Bis： 2040<10>100完全透明且有弹性很脆.易碎，不透明糊状不成形,HMhmiiih上海交通大学医学院凝胶总浓度工100ml凝胶溶液中含有Acr和上海交通大学医学院Bis的总克数。T= (a+b) /mx
6、100%T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大,的物质。交联度CBis占单体与交联剂总量的百分比。C=b/ (a+b) x 100%当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小。上海交通大学医学院讲课内容Ui不连续PAGE(Discontinuous PAGE)按具体操作分垂直板形电泳按凝胶系统的均匀性分continuous PAGEI discontinuous EAG&r上海交通大学医学院Tris (+) Glycine (-)electrophoresis technique上海交通大学医学院Disc-PAGE电极槽缓冲液通常为PH
7、8.3 Tris-甘氨酸缓冲液成分作用样品 胶*T=3% C=20%单体 索欲分离的样品溶液pH6. 7 Tris-HCl缓冲液 混在一起，用光聚合方法聚 合而成的大孔凝胶有防对流作用上海交通大学医学院Disc-PAGE上海交通大学医学院成分作用缩 浓胶除不加样品外，其余组成成 分同样品胶相同样品在此胶中 被浓缩成分作用离 分胶*T=7%C=2. 5%单体溶液*pH8. 9 Tris-HCl缓冲液 化学聚合法聚合成小孔胶主要的电泳分 离部分1.浓缩效应 1）凝胶层的不连续性两层凝胶T与C不同-孔径不同浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大 孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。2）缓冲液离子
8、成分的不连续性动，进入浓缩胶（PH6.7）,甘氨酸解离度（a）很小，有效迁移率（M a）很低，移甘氨酸（dI=6. 0 ）在dH8. 3带负电,朝正极移动速度较慢，称为慢离子.HU是强电解质,a=l, Cl-有效迁移率大,移动速度快.称快离子,喀蛋白质（pI<6.0）带负电荷，有效迁移超于两者之间。一言二！：上海交通大学医学院pH8. 3 Tris-Glycine buffer上海交通大学医学院3) pH值的不连续性为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率，必须使浓缩胶与分离胶之间PH 值有所区别.上海交通大学医学院3.分子筛效应与电荷效应进入分离胶后，Gly-成为快离子 分离胶只有
9、电荷效应和分子筛效应，根据各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而 分离上海交通大学医学院I k RmJj Cds Mo 以 sks“内卜1阿dweb向e碘 成皿的< Pb/irioa iht lamplc kid 吸产& on the 44 履 c fifftM and jourc ，砌 e bad thtjtl2. Side iht dcctndc 画此岫 山 id ili u;付小r Ha/iipjniwf3. SM tbc inner (hinder 匕 press- 皿 doMi on the 乩什疝 luscmblj 面;d群砌 do网the two jtfi ”砒 露出
10、sa”h d叫斑加西mLoad a sample into a polyacrylamide gel electrophoresis well1方嘎0 白' 上海交通大学医学院rf eSuleselectrophoresis阂就争Decreasing molecular weightBuffer _BuIRiStained polyacry lamide gelSDS-treated samples loaded in wellsPower supplySample lanes1SDS-polyacrylamide _一，" gel between glass plates五、PAGE的特点上海交通大学医学院i,具有分子筛效应，分辨率高2 .样品不易扩散，用量少,灵敏度可达10-6g3 .化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定的 亲水基团4 .凝胶不带电荷，消除了电渗现象5 .机械强度好，6 .网孔可调节1 .掌握（不连续）PAGE的原理2 .掌握影响PAGE迁移率的因素3 .掌握PAGE的操作注意点、试剂作用4 .熟悉PAG的聚合名词解释L凝胶总浓度2.交联度问答题1,与CAME相比，PAGE有哪些特点.2.试比较CAME与PAGE操作的区别.3.简述不连续PAGE的原理。上海交通大学医学院