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1、考马斯亮蓝G-250 标准曲线法测定蛋白含量实验目的：学习和掌握考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质含量的原理和方法。实验原理：考马斯亮蓝G-250（ Coomassie brilliant blue G-250 ）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm ；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。 其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在 2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是1976 年 B
2、radford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高 4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为01 000 NgL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。材料、主要仪器和试剂1 实验材料新鲜绿豆芽2 主要仪器（ 1）分析天平、台式天平（ 2）刻度吸管（ 3）具塞试管、试管架（ 4）研钵（ 5）离心机、离心管（ 6）烧杯、量筒（ 7）微量取样器（ 8）分光光度计3试剂（ 1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL蒸储水中，即为1 000 NgL的原液。（2）蛋白试剂考马斯亮蓝 G-250的配制：称取100mg考
3、马斯亮蓝G-250 ,溶 于50mL90 %乙醇中，加入85% （W/V）的磷酸100mL,最后用蒸储水定容 到 1 000mL 。此溶液在常温下可放置一个月。（ 3）乙醇（ 4）磷酸（85）四、操作步骤1 标准曲线制作（1） 0100gL标准曲线的制作：取6支10mL干净的具塞试管，按表1取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min 后用 1cm 光经的比色杯在 595nm 波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm ， 并做标准曲线。低浓度标准曲线制作管号1%34二61 00。u g . mL标准蛋白液ImLj00.020 040 060.0B0.10蒸镯水fmL，100OP
4、S0.960 940 920 90考马斯克18G250试剂1mL)555555击白垢含量(u g)0204060so100OD制由抖也， H2 .样品提取液中蛋白质浓度的测定(1)待测样品制备：称取新鲜绿豆芽下胚轴 2g放入研钵中，加2mL蒸储水 研磨成匀浆，转移到离心管中，再用 6mL蒸储水分次洗涤研钵，洗涤液 收集于同一离心管中，放置0.51h以充分提取，然后在4 000r/min离 心20min ,弃去沉淀，上精液转入10mL容量瓶，并以蒸储水定容至刻 度，即得待测样品提取液。(2)测定：另取2支10mL具塞试管，按下表取样。吸取提取液 0.1mL (做 一重复)，放入具塞刻度试管中，加入 5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试 齐1J,充分混合，放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色，记 录光密度OD595nm,并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含 量X (pg)。以标准曲线1号试管做空白。结果计算X样品蛋白质含量 u g/g i¥®)=提取液总体积(mL)测定时以样体积imL1样M鲜重(g)式中：X为在标准曲线上查得的蛋白质含量（小g)实验结果:测得数据123456OD01.52.8014.0015.1046.01标准曲线测得样品蛋白OD 595nm为3.353经计算的样品蛋白浓度为54.9318闻