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1、实验二 凯氏定氮法测定牛奶中蛋白质的含量一、实验目的与要求1. 掌握半微量凯氏定氮法的原理。2. 熟悉利用半微量凯氏定氮法测定干酵母片中蛋白质含量的操作方法。二、实验原理蛋白质是含一定量氮的有机化合物，蛋白质样品在凯氏烧瓶中经过浓H2SO4 消化后，有机物炭化生成碳，碳将硫酸还原为 SO2,本身则变成CO2, SO2使N还原为NH3,本身则 氧化为S2O3而消化过程中生成 H2,又加速了 NH3的形成。在反应过程中，生成的 H2O和 S2O3溢出，而NH3则与H2SO4结合成（NH4） 2SO4存在溶液中，加入NaOH并蒸储，使NH3 溢出，用H 3PO3 吸收后，以标准酸溶液滴定，根据标准酸
2、溶液消耗的量计算样品中的含氮量，从而可以折算出蛋白质含量。三、实验材料、试剂与仪器1. 材料与试剂浓 H2SO4、K2SO4、CuSO4 5H2。、NaOH、HCl、H3P。4、甲基红、乙醇、澳甲酚绿、 牛奶、定量滤纸等。40 %NaOH 溶液： 40 g NaOH 溶于 100 mL 水中；0.05 mol/LHCl 标准液：4.2 mL HCl 溶于 1000 mL 水中，碳酸钠法标定盐酸；2 % H3BO3溶液：H3BO3 2 mL 溶于 100 mL 水中；加速剂：K2SO4 150 g , CuSO4 - 5H2O 10 g仔细混匀研磨。甲基红溴甲酚绿混合指示剂：甲基红溶于乙醇配成0
3、.1 % 乙醇溶液，溴甲酚绿溶于乙醇配成0.5 % 乙醇溶液，两种溶液等体积混合，阴凉处保存（保存期三个月以内）。2. 仪器消化管、小漏斗、研钵、玻璃珠、酸式滴定管、锥形瓶、天平、凯氏定氮仪等。四、实验方法与步骤1. 样品消化1）牛奶5 mL置于消化管内，加入加速剂 5 g,并沿烧瓶壁缓缓加入 20 mL浓硫酸，加 入玻璃珠23 粒，摇动烧瓶使全部样品浸没于硫酸。2）消化管放在消化炉支架上，套上毒气罩，压下毒气罩锁住二面拉钩。3）把支架连同装有试样的消化管一起移至电热炉上保持消化管在电炉中心，设定温度在 420 保持消化管中液体连续沸腾，沸酸在瓶颈部下冷凝回流。待溶液消煮至无微小碳粒、呈蓝绿色
4、时继续消煮5 min 左右。4）消化结束，将支架连同消化管一同移回消化管托底上，冷却至室温。注意，在冷却 过程中，毒气罩必须保持吸气状态（切忌放入冷水中冷却）放置，防止废气溢出。2 .样品蒸储1）打开自来水给水龙头，使自来水经过给水口进入冷凝管。注意水流量以保证冷凝管 起到冷却作用为止。2）开总电源开关，待红色指示灯亮起，按一下汽按钮待蒸汽导出管放出蒸汽，按消除 按钮停止加热。3）在蒸储导出管托架上，放上已经加入适量（15 mL左右）的接受液（硼酸和混合指示剂）的锥形瓶。抬起锥形瓶支架使蒸储导出管的末端浸入接受液内。4）在消化完全冷却后的消化管内，逐个加入10 mL左右蒸储水稀释样品。5）向下
5、压左侧手柄，将消化管套在防溅管密封圈上，稍加旋转使其保持接口密封，拉 下防护罩。6）按一下蒸汽按钮，开始蒸储，到时或到量时自动停止。用洗瓶将蒸储水冲洗接收， 取下锥形瓶。7）加碱：按一下碱按钮，NaOH溶液量必须至蒸储液碱性颜色变黑为止。3 .滴定与计算吸收氨后的吸收液，用标定后的盐酸溶液进行滴定，溶液由蓝绿色变为灰紫色为滴定终点。100 %粗蛋白质 = (V2V1) C 0.014 K式中：V2样品时消耗酸标准溶液的体积，mL;V1滴定空白时消耗酸标准溶液的体积，mL ;V'试样消解液蒸储用体积，mL ;V样品分解液总体积，mL ;C酸标准溶液浓度，mol/L ;K氮换算成粗蛋白质的系数，牛奶为；W样品质量，g;0.0140 氮的毫克当量数。五、思考题1. 能否使用碱溶液进行滴定，应如何设计实验？2. 凯氏定氮法是否适用于所有含氮化合物的测定？3. 何谓样品消化？在定氮仪的反应室内将发生什么化学反应？