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1、结核杆菌Hsp65和hGMCS双顺反子表达质粒的构建与表达【摘要】目的：应用分子生物学技术，构建 pIHsp65GM双顺反 子真核表达质粒，并在真核细胞中表达.方法：以结核分枝杆菌H37Rv 株基因组为模板经聚合酶链反应(PCR犷增出Hsp65基因，同时从质 粒pORF hGM CSF中扩增出基因佐剂hGM CSF分别克隆到真 核表达载体 pIRES的多克隆位点 A (MCSA和B (MCSB中，构建 phsp65GM3l核表达质粒，并转染 HepG 2细胞中表达和检测.结 果：酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为 1.64 kb和0.47 kb , 测序分析表明克隆的Hsp65和hGM CS
2、Fff歹J与GenBank±N布序列 完全一致；免疫组织化学方法检测到表达Hsp65的阳性细胞；ELISA方法检测到phsp65GM转染组细胞培养上清中hGM CSF的表达，与 空载体对照组比较差异有统计学意义(P<0.01). 结论：成功构建 和表达了 phsp65G懒粒，为研制优于卡介苗的新型抗结核病 DNAS 苗奠定基础.【关键词】 结核分枝杆菌；热休克蛋白 65;人粒巨噬细胞集 落刺激因子；双顺反子；基因佐剂0引言卡介苗(bacille calmette guerin, BCG是已被广泛应用于预防结核病(tuberculosis, TB )的减毒活疫苗.由于结核
3、DNA疫苗的制备简便、免疫效果好，目前已经成为TB的热门侯选疫苗之一 1.结核杆菌热休克蛋白 65KD基因(heat shock protein 65KD,Hsp65)是研究最早的结核抗原之一，可以在动物体内对结核分枝杆菌的感染产生强烈的保护性免疫反应2.粒细胞吞噬细胞集落刺激因子 （granulocytemacrophage colony stimulating factor, GM CSF）乍为良好的基因佐剂，可以利用其上 调机体免疫水平的作用增强 DNAS苗的效能3-4.虽然Hsp65抗 原和GM CSF分别在感染免疫中的作用已经被研究证实有效，但对 人GM CSF协同Hsp65抗原在结
4、核杆菌感染中的免疫应答特点和保 护力尚不清楚5.我们将两者同时克隆到同一载体上，构建含结 核杆菌Hsp65和基因佐剂hGM CSF的双顺反子真核质粒，旨在为进 一步了解结核DNA5苗的免疫效果奠定基础.1材料和方法1.1 材料结核分枝杆菌H37Rv株基因组，大肠杆菌DH& ,载体pIRES 和质粒pORF hGM CSF暨南大学医学院微生物学与免疫学教研室 提供）；Ex Taq DNA聚合酶，T4 DNA连接酶，限制性内切酶 Nhe I, EcoR I, Xba I 和 Not I , DL 1 kb marker ,质粒提取试剂盒，DNA 凝胶回收纯化试剂盒（大连宝生物公司）；两对P
5、C咫I物、重组质粒上 目的基因的序列测定由上海生工生物工程公司完成；Transmaster转染试剂（广州博理生物科技公司）；即用型免疫组化Biotin SPHRP式齐I盒，DABB底物显色试剂盒（北京鼎国生物科技公司）； 鼠抗人Hsp65蛋白单克隆抗体和人hGM CS磁白ELISA检测试剂盒 （深圳市晶美生物科技公司）.1.2 方法1.2.1 目的基因Hsp65和hGM CSF的PCRT增参照GenBan吐结核分枝杆 菌H37Rv株Hsp65基因CDS序歹J （ NCBI登陆号：M15467分别设计 引物进行PCFT增.1.2.2 pIHsp65真核载体的构建与鉴定将Hsp65的PCFT物经过
6、回收2化后与载体 pIRES,同时用 Nhe I和EcoR I双酶切，酶切后进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，并经 过凝胶回收纯化试剂盒回收酶切产物，将两者酶切纯化的产物按照 3： 1的摩尔比混合，用T4 DNA连接酶连接24 h.转化用低温CaCl2 制备的E.coli DH5 %感受态细菌，然后涂布于含氨节青霉素50g/mL的LB固体培养基中.次日，随机挑取10个单菌落，分别接种于 3 mL含氨节青霉素的LB培养液中，37C下150 r/min振荡培养过夜.先取少量菌液煮沸作为模板进行 菌落PCR佥测是否有Hsp65的存在，将菌落PC磁选呈阳性的菌落用 质粒提取试剂盒抽提质粒 DNA将提取白
7、质粒DNAffl Nhe I和EcoR I 双酶切，进行电泳检测，以 DL 1 kb marker为分子量参照， 将筛 选出的阳性克隆产物的菌液进行测序鉴定.测序采用Sanger双脱氧 链终止法，对插入序列的两端进行测定，测序工作由上海生物工程公司完成.1.2.3 pIHsp65GM 真核表达质粒的构建与鉴定同构建pIHsp65载体方法一样，将hGM CSF的PCR物经过回收2化后与载体 pIHsp65同时用Xba I和Not I双酶切，酶切产物经凝胶回收纯化后，将两者酶切纯化的产物按照 3： 1的摩尔比混合，用T4 DNA连接酶连接24 h,然后转化感受态细 菌E.coli DH5 % ,涂
8、布于含氨节青霉素 50区g/mL的LB固体培养基 中.次日，随机挑取10个单菌落，分别接种于3 mL含氨节青霉素的 LB培养液中，37c下150 r/min振荡培养过夜.将菌落PC确选呈阳 性的菌落用质粒提取试剂盒抽提质粒 DNA将提取白质粒DNA! Xba I 和Not I双酶切，进行电泳检测，以 DL 1 kb marker为分子量参 照，将筛选出的阳性克隆产物的菌液进行测序鉴定.1.2.4 细胞转染取对数生长期的HepG 2细胞接种在12孔板内，待细胞 生长至70%- 80 %0寸， 加入阳离子多聚体转染试剂 Transmaster和 质粒phsp65GM的混合物.饥饿培养1 h,力口入
9、含100 mL/L小牛血清 的完全培养基，培养24 h后，检测Hsp65和hGM CS磁白的表达.1.2.5 Hsp65蛋白表达的免疫组化检测采用未转染细胞为空白对照和转染了空质粒pIRES的细胞为阴性对照，将空质粒 pIRES和重组质粒pIHsp65GM转染HepG 2 细胞48 h,去除培养液，用磷酸盐缓冲盐水PBS冲洗.经40 g/L的多 聚甲醛固定后，依次滴加过氧化酶阻断剂，正常动物非免疫血清，1 ： 1000鼠抗人Hsp65蛋白抗体，生物素标记二抗和链霉素抗生物素蛋白. 最后加入新鲜配制的 DAB工作液染色，显微镜下观察结果，Hsp65蛋 白的表达以细胞质染呈棕黄色者为阳性.1.2.
10、6 ELISA 法检测hGM CSF蛋白表达水平分别收集 pIRES和质粒pIHsp65GM 转染24 h和48 h的HepG 2细胞的细胞培养的上清液，采用 ELISA 双抗体夹心法检测hGM CSF蛋白的表达量，按照试剂盒说明进行操作.用酶标仪在吸光度A450 nm下测定样品和试剂盒提供的标准品的A值.根据标准品所测A值绘制的蛋白浓度与 A值相关标准曲线计算各样品中hGMCSF蛋白的含量（以空白孔调零）.统计学处理：实验数据以x士 s表示，采用SPSS 13.0软件包进行分析，组间比较采用两样本t检验，P<0.05 为差异具有统计学意义.2结果2.1 Hsp65和hGM CS
11、F®因PCFT增产物电泳分析琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCFT物分别为1.64 kb和0.47 kb的特异性片段，与预期 Hsp65和hGM CSFS因大小相符（图1）.2.2 重组质粒限制性内切酶消化鉴定质粒pIHsp65经Nhe I和EcoR I双酶切后，电泳可见大小约6.1 kb与1.64 kb两片段，与载体pIRES经Nhe I和EcoR I双酶切 产物和Hsp65基因PC*物的2条特异性条带对比，大小相符（图2A）.重组质粒pIHsp65GMi5 Xba I和Not I双酶切后，电泳可见大小约为7.74 kb与0.47 kb两片段，与质粒pIHsp65经Xba I和Not I
12、双酶 切产物和hGM CSF基因PCFT物的2条特异性条带对比，大小相符（图 2B）.2.3 序列分析鉴定对质粒pIHsp65上的多克隆位点A(multiple cloning sites A,MCSA内的DNAff列进行序列分析鉴定，结果与结核分支杆菌H37Rv 株的Hsp65的基因序列完全相同.对质粒pIHsp65GMi的多克隆位点 B(multiple cloning sites B, MCSB) 内的 DNAff列进行序列分析鉴 定，结果与hGM CSF的基因序列完全相同.2.4 Hsp65蛋白在HepG 2细胞中的表达显微镜下观察，与未转染细胞的空白对照和转染空质粒 pIRES细胞的
13、阴性对照对比，phsp65GM专染的部分HepG 2细胞中 胞质染呈棕黄色，表明Hsp65表达呈阳性(图3).2.5 ELISA 检测pIRES对照组在转染24和48 h时细胞上清液hGM CSF勺 表达量分别为(1.371 ±0.083) pg/mL 和( 1.782 ±0.127) pg/mL (n=3),而pIHsp65GMB转染24和48 h时细胞上清液hGM CSF勺 表达量分别为(271.103 ±4.731 ) pg/mL 和(253.124 ± 3.943) pg/mL; phsp65GM专染组在转染24和48 h时hGM CSF的表达量
14、与pIRES对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.01 )3讨论近年来，对结核研究最多的抗原主要有 Hsp65,Ag85B, ESAT6 和MPT6得6-7.其中Hsp65具有免疫优势抗原的特性，能诱导和 增强机体的体液免疫和细胞免疫的发生，并可激活丫 S T细胞，分泌 高水平的IFN 丫和杀伤感染的细胞，是人体感染结核杆菌以后免疫 系统的主要靶抗原，是T细胞攻击的主要对象8,由于仅含有单 抗原基因的DNAS苗并不足以引发良好的免疫效果，还需要结合其他 的手段如基因佐剂，特别是将细胞因子与DNAS苗共表达才能产生更 强的免疫保护力.GM CSF作为DNAS苗的免疫佐剂，能够调节
15、树突 状细胞的分化和成熟，以及MHCffi共刺激分子的表达水平，并且通过 调节抗原提呈细胞尤其是树突状细胞的数量和功能来调节免疫应答 的强度.有研究认为将GM CSF乍为佐剂与基因疫苗共同免疫小鼠结 果比单独应用基因疫苗产生更强烈的细胞免疫应答并可提供更强的 免疫保护力3-5.本实验采用载体pIRES为双顺反子真核表达质粒， 在上下游克隆位点之间的序列为内部核糖体进入位点，此段序列在转录后能够自动断裂，使上下游克隆位点插入的基因能够独立高效 的表达，从而避免了融合表达蛋白活性低下问题 ，为两种蛋白表达、 动物实验和结核疫苗研制提供较大方便.与以往结核DNA度苗的研究比较，本实验具有以下特点：实
16、 现了目的基因与细胞因子基因在同一载体上共同表达.如果将DNA& 苗与编码GM CSF的质粒混合注射会对DNAS苗的免疫效果产生干 扰作用；若将GM CSF与目的基因共同克隆到一个载体中，由于两 个基因具有相同的局部微环境，往往可以获得较好的免疫效果9.本研究使用双顺反子真核表达载体pIRES,将两个基因分别克隆到两个多克隆位点，两者各自表达，不相互影响蛋白表达的空间结构.因为表达为融合产物的DN砥苗可能破坏抗原的三维结构，对抗体的 生成产生负面影响10.【参考文献】1 Mustafa AS. Development of new vaccines and diagnostic rea
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