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1、微生物突变体的获得方法,Home,label,来源：生物技术通报 2010年第2期 构建微生物突变体的方法综述 张念章 逯忠新,突变体,什么是突变体？,定义1： 一般指带有已经发生突变的基因的细胞、病毒或细菌，有时也指发生突变的基因。,定义2： 携带突变基因的细胞或个体。,(mutant),Home,label,化 学 方 法,Home,label,back,物理方法,1.紫外,2.电离辐射,3.离子注入,4.微波,5.其它,Home,label,back,紫 外,紫外线是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶有很强的紫外吸收能力，最大的吸收峰在260 nm 。 因此，
2、波长在200-300 nm的紫外光才有诱变作用。紫外线可引起生物体形成嘧啶(主要是胸腺嘧啶)二聚体、嘧啶水合物和引起DNA分子交联。 其中形成嘧啶二聚体的生物学效应研究的比较清楚。由于二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，引起双链结构扭曲变形。同时又会妨碍双链的解开，阻碍碱基正常的互补配对，影响DNA的复制和转录，从而导致突变或死亡。 尽管不断有新型的诱变技术产生，紫外诱变技术因其操作简单，效果显著，在很多领域仍然发挥重要作用。,Home,label,back,电离辐射是指一切能引起物质产生电离作用的辐射总称。生物学上常用射线进行辐射，此外还有射线、射线和快中子等。这些射线可直接将能量传递给生物
3、分子，使细胞中有序排列的生物大分子处于激发和电离状态。引起遗传物质的变化主要是碱基的氧化作用，糖苷键及DNA单链键或双链键断裂。伴随着生物大分子化学键的断裂，有机体内产生大量的离子和自由基。这些自由基与细胞中的溶质分子相互作用，诱发酶的释放，导致代谢的方向性和协调性紊乱，促使开始的生物化学损伤进一步发展，引起了机体内环境的进一步变化。,电离辐射,Home,label,back,离子注入技术最早用于农作物育种，近几年来因其在微生物诱变育种中的高效性，得到了越来越广泛的应用。离子注入生物体内会在动量、能量和 质量的三重作用下产生不同的生物学效应。因此，与生物体的相互作用存在峰值，在峰值范围内，注入
4、离子与生物体的相互作用是局部的、双重的和不易修复的。 在离子注入过程中，生物分子将会吸收能量，经历复杂的物理和化学的变化，产生各类自由基。这些活性自由基，不但可以引起正常生物分子的损伤，致使细胞中的染色体畸变，DNA链断裂，也可使质粒DNA形成断裂点。产生染色体重复、易位、倒位，碱基缺失等多种生物学效应。离子注入技术与目前其它的诱变源相比，具有LET值高，射程可控，集束性好，能量沉积和质量沉积区域集中等优点，在不同的作物及菌种的诱变育种中发挥出巨大的作用.,离子注入技术,Home,label,back,微波辐射属于一种非电离性高频电磁波，在300 MHz一300 GHz范围内有较强的生物效应，
5、主要对生物体产生热效应和非热效应。在微波作用下，生物体会产生局部温度上升(热效应)以及非温度关联的各生理生化反应(非热效应)，进而产生一系列突变效应。,除上述的方法之外，还有利用其它物理因素进行的诱变，如利用激光、太空条件等，或多种方法联合使用构建生物突变体。,微波辐射,Home,label,back,化学 诱变 方式,1.烷化剂,2.其它诱变剂及复合诱变,Home,label,0.化学诱变,back,化学诱变剂是一类能和DNA起作用，进而改变DNA的空间结构或者结构组成，导致DNA产生变异的物质。按其诱变机制可分为碱基类似物诱变剂、直接诱变DNA结构的诱变剂和诱发移码突变的诱变剂3类。利用化
6、学诱变剂进行的化学诱变具有使用方便，特异性较强和诱变后代较易稳定遗传等特点。 该方法已培育出许多具有生产利用价值的微生物新品种，给生产带来了巨大的经济效益和社会效益.,Home,label,back,烷化剂又称生物烷化剂，是一类能形成碳正离子或其它亲电性基团的化合物。常用的烷化剂包括亚硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙醋(DMS)和硫酸二乙酯(DES)。其中Ems是目前公认的效果最好和应用最广的一种化学诱变剂。其诱变作用主要发生在鸟嘌呤N7位置上，烷基取代H离子后，使之成为一个带正电的季铵基团，从而发生两种遗传效应：一是烷化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对，代替胞嘧啶，发生转换突变(即G
7、：C变为A：T)；二是由于鸟嘌呤的N-7烷基活化，糖苷键断裂造成脱嘌呤，鸟嘌呤的位置成了一个空位，复制时其互补位置上的碱基就不受严格的配对限制，4种碱基都有机会进入，从而造成置换现象。此外，EMS还可以造成糖磷酸骨架断裂，引起染色体缺失。与其它诱变剂相比，EMS诱变后产生的突变频率高，且多为显性突变体，易于突变体的筛选。,烷化剂,Home,label,back,除了烷化剂外，平阳霉素(PYM)、秋水仙素、5-溴尿嘧啶(5-BU)、2-氨基嘌呤(AP)等也常用于诱变工作。,其它诱变剂及复合诱变,将两种或多种诱变剂的联合应用于突变育种工作中就形成了复合诱变。该诱变过程包括：两种或多种诱变剂的先后使
8、用；两种或多种诱变剂的同时使用；同一种诱变剂的交替重复作用等。普遍认为，如果将两种或两种以上诱变剂合理搭配使用，诱变剂间的协同效应会产生较单一诱变更好的效果。 以一株绿色木霉F1为出发菌株，经紫外线、亚硝基胍、硫酸二乙酯三种因素依次处理，以每一轮诱变处理筛选到的酶活最高的突变株作为下一轮诱变的出发菌株。,Home,label,back,基因工程方法:,1.DNA标签法,2.基于载体构建的突变体,3.基因打靶技术,4.RNA干扰技术,Home,label,back,当一段特定的DNA序列插入到基因组目的因的内部或其附近位点时，便会诱发该基因发生突变，形成突变体。 根据这一作用原理，用已知的插入D
9、NA分子做探针，发展出来一种分离未知基因的方法。由于插入的DNA序列，相当于人为的给目的基因加上一段已知的序列标签，因此称DNA插入突变分离基因的技术为DNA标签法，亦叫基因标签法。 它包括TDNA标签法和转位子标签法两大类。其中转位子标签法又可分为同源转位子标签法和异源转位标签法,基因标签法,Home,label,back,常用的构建突变体的载体包括质粒载体、噬菌体载体以及二者部分结构组合成的噬菌粒载体。细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份，可以持续稳定的处于染色体外的游离状态。人们利用质粒转移技术打破物种界限，赋予生物新的遗传性状，使外源基因在受体细胞内按照人们期
10、望的方式进行表达，并进行基因功能分析等研究。与质粒相似，噬菌体也可作为外源基因表达的载体。最常用的噬茵体载体是入噬菌体载体。 根据使该载体失活的方法，又可以分为插人型载体和替换型载体。利用入噬菌体实现基因克隆和表达的有DNA连接酶、DNA聚合酶I等。由部分质粒载体和部分单链噬菌粒载体组合而成的具有双功能的新型大肠杆菌克隆载体系列，就形成了噬菌粒载体。它有两个复制起点，其一来自ColEl，其二来自单链噬菌体。此载体具有分子量小、克隆能力大、可遗传稳定等优点。基于载体构建微生物突变株，特别是用质粒为载体，是目前在基因工程中应用较多的构建突变体的方法。,基于载体构建的突变体,Home,label,b
11、ack,20世纪80年代后期发展的基因打靶技术，通过在转染细胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重组，真正实现了外源基因定点整合到基因组特定位置上的目的，从而可以有针对性的改变细胞的遗传特性。基因打靶的分子基础是两条具有相同或类似核苷酸序列的同源DNA分子之间发生的遗传信息的重组事件。因此，基因打靶需要首先将要整合到受体细胞核基因组目标座位的外源打靶基因，以及位于打靶基因两侧与内源目标基因同源的DNA片段，克隆在具有选择性标记基因的载体(如自杀性质粒载体)上，构成专用的基因打靶载体。之后再将其转化进感受态的受体细胞。由于外源打靶基因的两侧与内源核基因组上的目标基因或座位之间存
12、在着同源的DNA序列，两条DNA链的相同部分便会相继发生单链断裂、链的交换、磷酸二酯键的形成和缺口重新封闭等一系列变化，并最终完成同源重组，实现外源基因在核基因组DNA上的定点组合。基因打靶的效率取决于DNA同源重组的频率，这与两条重组DNA分子之间的同源序列的长度密切相关。现在，该技术在检测基因功能、治疗遗传疾病等方面有着研究与应用。,基因打靶技术,Home,label,back,20世纪90年代发现的RNA干扰(简称RNAi)现象也可以高效而特意的阻断体内相应基因的活性，发挥基因剔除的作用。 RNAi引起基因沉默的大致过程是外源性的dsRNA在Dicer酶的切割下形成2125 bp的siR
13、NA。该siRNA便会同RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)结合，并将其激活。激活状态的RISC催化ds-siRNA发生解旋和解链。其中的反义链会附着在RISC表面与mRNA配对，形成新的siRNA，再循环作用于另外靶的向mRNA。另一条链会被释放分解。这种不断放大的瀑布式作用形成大量新的siRNA，使siRNA在短时间内迅速有效的抑制mRNA翻译，从而有抑制靶向基因蛋白或多肽的合成。内源性的mRNA会因存在反向重复序列而形成发卡结构的miRNA，也会产生RNAi。其过程与siRNA形成RNAi的过程虽有差别但大致相同。现已发现在真菌等绝大多数真核生物中都有RNAi现象的发生。人类应用RNAi技术，必将带来操控生物性状改变的新的革命。,RNA干扰技术,Home,label,back,