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1、1,第 五 章动物细胞制药,2,第一节 概 述,1、动物细胞培养的定义动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。,3,2、动物细胞培养的历史,（1）开始-1907，Harrison用蝌蚪的髓管放于一滴淋巴液内，培养出神经元。（2）成熟-以人的肿瘤细胞与组织为材料建立的各种细胞系，如Hela细胞系。,4,3、动物细胞培养的优点,（1） 细胞经培养后形成的细胞系和细胞株，特征均一。 （2） 理化环境可控制，培养物可直接被观测。 （3） 提供大量均一的细胞供制备用。 （4） 便于进行人工
2、筛选。 （5） 结合显微影相技术，可观察细胞代谢活动和反应。目前，动物细胞培养技术已经广泛应用于病毒学，免疫学，遗传学，肿瘤学，分化及发育，细胞毒理试验，生物技术等各个领域。,5,4、动物细胞培养的类别,1、动物组织培养2、动物细胞培养（1）细胞团块单层培养（2）单细胞克隆株培养3、原代细胞培养（1）初代培养（2）细胞株确立培养4、细胞继代培养,6,第二节 动物细胞的生理特点,一、动物细胞的形态 适应功能,形态各异。 离体培养细胞分两类： 贴壁细胞 悬浮细胞,7,8,贴壁细胞 生长须有贴附的支持物表面， 自身分泌或培养基中提供的贴 附因子才能在该表面上生长。 两种形态： 成纤维细胞型 上皮细胞
3、型,9,动物细胞贴壁生长特性,10,悬浮细胞 生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如淋巴细胞。兼性贴壁细胞 生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。,11,（2）超净工作台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。100级超净工作台指标：（0.5m3.5粒/L）,12,培养器具,培养瓶,培养板,培养皿,13,（4）倒置显微镜,14,（5）纯化水装置,15,二、动物细胞的生理特点, 细胞的分裂周期长 细胞分裂时间为1248h， 细胞的分裂 周期=间期+分裂期 间期（G1+S+G2） 分裂期（M）,16,17,G1期
4、：46h 合成DNA聚合酶 RNA合成S期：68h DNA合成G2期：25h DNA量加倍, RNA合成M期：0.51h 染色体分裂,18,19,细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制现象。正常二倍体细胞的生长寿命是有限的。 原代培养 有限细胞系 无限细胞系,20,动物细胞对周围环境要求十分严格，对理化因素很敏感：如：渗透压、pH、离子浓度、剪切 力、微量元素等。,21,动物细胞对培养基要求高： 必需氨基酸、维生素、无机盐、 微量元素、葡萄糖、细胞生 长因子、贴壁因子等。,22,动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。 动物细胞蛋白质的合成部位： 游离核糖体 粗面内质网的核糖体,23,游离核
5、糖体合成蛋白质用于细胞质基质内。 粗面内质网的核糖体合成蛋白质是分泌的，并在膜中整合修饰为蛋白多糖、糖蛋白等，由粗面内质网提供膜形成大囊泡分泌出胞外。,24,动物细胞生产药物缺点:培养条件高、成本贵、产量低。优点:分泌胞外、纯化方便、翻译 后修饰糖基化，与天然产品一致。,25,第三节 生产用动物细胞的要求和获得,一、生产用动物细胞的要求 原代细胞 二倍体细胞系 转化细胞系,26,二、生产用动物细胞的获得,原代细胞是直接取自动物组织器官,经过粉碎消化而获得的细胞悬液（109/g）。需要大量动物，费钱费劳力。鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、淋巴细胞。,27,原代细胞培养,定义：从新鲜供体取得组织
6、细胞后在体外进行首次培养，一般持续14周。步骤：取材-组织分离-培养,28,二倍体细胞系原代细胞经过传代筛选克隆， 从多种细胞成分的组织中，挑 选并纯化出某种具有一定特征 的细胞株。,29,二倍体细胞的培养意义,二倍体细胞：（1）具有二倍性染色体（2n），染色体核型正常。（2）培养条件下只具有有限的生命力，不能进行无限期的分裂繁殖。（3）无致癌性。培养意义：二倍体细胞保留着在位组织正常的细胞性状。（1）可用于生产疫苗、尿激酶、干扰素等药物的生产。（2）也可用于细胞遗传学、细胞分化及衰老的研究、以及药物的细胞毒性、环境污染的细胞学检测。,30,转化细胞系 通过某个转化过程形成的，常 由于染色体断
7、裂变成异倍体， 失去正常细胞特点，而获得无 限增殖能力。转化过程可以是 自发的，和人工的，从肿瘤组 织中。,31,三、生产常用动物细胞的特性,MRC-5：从正常男性肺组织中获得的人二倍体细胞系。核型为2n=46。有限寿命4246代。 培养基用加小牛血清，同工酶G6PD B型。,32,培养的该细胞株分泌的组织型纤溶酶原激活因子（t-PA）用于治疗心肌梗塞，脑栓塞、肺栓塞等血栓病。还可以治疗骨髓移植或化疗中出现的中性粒细胞减少的粒细胞集落刺激因子等疾病。,33,BHK-21:从5只无性别的生长1天的地鼠幼鼠肾脏中分离的;成纤维样细胞,核型为2n=44;培养基为DMEM加7%胎牛血清。用于增殖病毒，
8、包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞构建，表达重组凝血因子已投放市场，用于治疗血友病。,34,Vero：从正常成年非洲绿猴 肾脏分离的。 为贴壁依赖的成纤维细胞，核型2n=60；培养基为199培养基， 加5%胎牛血清。,35,该细胞株适于用于多种病毒的增殖，包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、 狂犬病毒等，现重组的多种疫苗已投放市场。,36,复习与作业,何谓动物细胞工程制药？有何优点？生产用动物细胞有何要求？如何获得动物工程细胞？,37,四、基因工程细胞构建和筛选,在生产中采用更多的更有前景的是 融合细胞及采用基因工程构建的各 种工程细胞。,38,真核细胞基因表达载体的构建使
9、用的载体有两类：病毒载体 牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、 杆状病毒质粒载体,39,牛痘病毒： 用构建多价疫苗 腺病毒、逆转录病毒： 用于基因治疗。 杆状病毒： 用于外源基因表达。,40,其作为载体的 优点： 双链DNA，易重组 插入78kb DNA不影响正 常病毒粒子的形成。,41,多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子；,42,多角体蛋白基因有非常强的 启动子，产生的蛋白质可占全 部蛋白质的20%30%；,43,用光学显微镜可看到多角体， 可以此作为标记物，选阳性克 隆。如用家蚕杆状病毒，还可在蚕 体表达外源基因。,44,质粒载体在细
10、菌和哺乳动物细胞 体内都能扩增。都含有如下基本 成分： 允许载体在细菌体内扩增的质 粒序列。 含有使基因表达的调控元件。,45,能用以筛选出外源基因已整 合的选择标记。 有时还带有选择性增加拷贝 数的扩增系统。,46,基因载体的导入和高效表达工程细胞株 的筛选,47,基因载体导动物细胞 常用方法是： 磷酸钙沉淀法 电穿孔法,48,磷酸钙沉淀法：溶解的DNA 加Na2HPO4和CaCl2 形成磷酸钙沉淀， DNA被包在磷酸钙沉淀中， 形成DNA磷酸钙共沉淀物，当 和细胞表面接触时，则通过细胞 吞噬作用而将DNA导入。,49,电穿孔法： 借助电穿孔仪的高压脉冲电场， 使细胞膜出现瞬时可逆性小孔， 外源DNA沿小孔进入细胞。转 化率较高，拷贝数低。,50,五、细胞库的建立 生产用的工程细胞必须建立两个细胞库： 原始细胞库 生产用细胞库,51,原始细胞库贮存时须有该细 胞的详细挡案，包括： 该细胞系的历史 该细胞系的特性 对各种有害因子的检查结果,52,生产用细胞库 从原始细胞库来的，或从单 一安瓶来，或从多个安瓶来 即刻混合，经培养扩增再分 装储存形成细胞库。,53,需建挡案， 进行无菌性无细胞交叉污 染的检查。 需确定最高使用的传代数。,