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1、实验五 薄层色谱和天然色素的提取（7学时）一、实验目的1.了解薄层色谱的一般原理和意义,学习薄层色谱的操作方法。2 .掌握液体有机化合物的干燥。3 .掌握天然色素的提取方法。二实验原理绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿L胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等 多种天然色素。其结构如下：CHCH2 RR=H：卩-胡萝卜素R = OH：叶黄素、NYR=CHm 叶绿素 a、人入一5 r = CH0;叶绿素b叶绿素中a的含量通常是b的3倍。尽管叶绿素分子含有一个极性基团， 但大的怪基结构使它易溶于醛、石油醛等一些非极性的溶剂。胡萝卜素是具有长链结构的共馳多烯，它有三种异构体，即c（或_、和y_ 异构体，其中异构
2、体含量最多,也最重要。生长期较长的绿色植物中，异构体 （M本的含量多达90%。体具有维生素A的生理活性，其结构是两分子维生素 A在链端失去两分子水结合而成的。在生物体内，体受酶催化即形成维生素A。 目前卩-体已可进行工业生产,可作为维生素A使用，也可作为食品工业中的色 素。叶黄素是胡萝卜素的轻基衍生物,它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两 倍。与胡萝卜素相比,叶黄素较易溶于醇而在石油醯中溶解度较小。故本实验采 用甲醇石油醛的混合溶剂提取以上三种色素。薄层色谱又称为薄层层析，属于固-液吸附色谱。其基本原理是利用混合物各 组分在某一物质中的吸附或溶解性能（分配）的不同,或其亲和性的差异,使混 合物的
3、溶液流经该种物质进行反复的吸附或分配作用,从而使各组分分离。当流动相（展开剂）带看混合物组分以不同的速率沿板移动,即组分被吸附 剂不断地吸附,又被流动相不断地溶解解吸而向前移动。由于吸附剂对不 同组分有不同的吸附能力,流动相也有不同的解吸能力。因此,在流动相向前移 动的过程中，不同的组分移动不同的距离而形成了互相分离的斑点。在给定条件 下（吸附剂、展开剂的选择,薄层厚度及均匀度等），化合物移动的距离与展开 剂前沿移动的距离之比值（Rf值）是给定化合物特有的常数。即：_样品原点中心到斑点中心的距离J 样品原点中心到溶剂前沿的距离影响Rf值的因素很多，如样品的结构、吸附剂和展开剂的性质、温度以及
4、薄层板的质量等。当这些条件都固定时，化合物的上気值Rf是一个持性常数。 但由于实验条件容易改变而不易固定，因此在鉴定一个具体化合物时，经常采用 与已知标准样品对照的方法。利用薄层色谱进行分离及鉴定工作，在灵敏、快连、准确方面比纸色谱优越。 薄层色谱的特点是:（1）设备简单,操作容易;（2）分离时间短，只需数分钟 到几小时即可得到结果，因而常用来跟踪有机反应监测有机反应完成的程度(3 ) 分离能小虽，斑点集中，特别适用于挥发性小,或在高温下易发生变化而不能用 气相色谱分离的物质；(4 )可采用腐蚀性的显色剂如浓硫酸,且可在较高温度下 显色；(5 )不仅适用于小量样品(几毫克)的分离,也适用于较大
5、量样品的精制 (可达500毫克X应该指出，薄层色谱是否成功，与样品、使用的吸附剂、展 开剂以及薄层的厚度等因素有关。三、试剂及器材1 器材：剪刀、研钵、布氏漏斗、圆底烧瓶、直形冷凝管、层析缸、玻棒、 洒精灯、石棉网、载玻片(2.5 cmx7.5 cm , 6块)。2试剂:硅胶G,竣甲基纤维素钠、中性氧化铝(150 160目)、甲醇、 95%乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醸菠菜叶。主要试剂及产品的物理常数名称性状比重熔点C沸点C溶解度：克/100ml溶齐1水乙酵46.07liq1.36000.7893-14478000000内酮58.07liq1.35880.78999456.2000000未完/请
6、自己查五、实验内容与基本操作1.薄层色谱(1 )吸附剂与展开剂：吸附剂（固定相）:用于与样品发生吸附作用的固定不动的物质。在混合物 样品流经吸附剂（固定相）的过程中,由于各组分与吸附剂（固定相）吸附力的 不同，就产生了速度的差异，从而将混合物中的各组分分开。一般常用的吸附剂 为氧化铝和硅胶。硅胶可分为硅胶H（不含黏合剂L硅胶G（含黏合剂）和硅 胶HF （含荧光物质，可在紫外光下观察）等。氧化铝同样也可分为以上几种类 型。展开剂（流动相）：也称洗脱剂,在色谱过程中起到将吸附在固定相上的样 品洗脱的作用。选择展开剂时应考虑样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素。展开剂的 极性越大，对化合物的解吸附
7、（洗脱）能力就越大，即Rf值就越大。如选用一 种溶剂（展开剂）后发现其样品成分的Rf值都比较大，则可换用一种极性较小 的展开剂，也可在原展开剂中加入一种极性较小的溶剂。展开剂的洗脱能力按下 列次序递增：已烷，四氯化碳，甲苯，苯，二氯甲烷，氯仿，乙醛，乙酸乙酯， 丙酮Z丙醇，乙醇,甲醇Z水。（2）薄层色谱的操作步骤薄层色谱是通过制浆、涂片、点样、展开及显色来完成的。 制浆 浆液的制备可分为干法和湿法。干法是将选好的硅胶G慢慢倒入 溶剂中调成糊状备用。湿法是将水和硅胶G按1 : 4的比例在搅拌下将硅胶G 慢慢地倒入水中调成糊状,不要反过来加,防止形成团块。湿法制浆要在使用前 调制,否则浆料容易凝固
8、结块。 涂片大量使用可用涂布器涂布。简单的涂布方法是将两片载玻片用月巴皂 水和水洗涤干净,再用碎滤纸吸干玻片上的水分,然后将其重養在一起,用手夹 住片的上端，慢慢浸入已调好的浆液浸涂2s左右(上端留一些不浸涂),然后缓 慢地将载玻片从浆液中取出，要求版面均匀平滑，载片边缘上的浆料用抹布轻轻 地擦去,小心将两片分开,放在磁盘中。待浆料自然干燥后放入烘箱，在105 110C下活化,约30min就制成了薄层板，取出来进行点样。 点样在活化好的薄层板下约lcm处的边上轻轻地用铅笔点一个标记作 为起始线。用一根内径约一毫米的毛细管吸取制备好的试样。吸取的试样不要太 多，防止样点扩散。在起始线的中央轻轻地
9、接触薄层板,点样要迅速,接触即刻 移开。待样点溶剂挥发后再重复点样约34次。样点直径不要超过2mm,太 大会出现拖尾现象。如果在一块薄层板上点两个以上的样点要分开距离。样点点 好后就可以展开。 展开 将展开剂倒入展开瓶或合适的广口瓶中,使液面在样点的下方,不 要接触到样点,否则样点会被溶入展开剂中无法进行展开。将薄层板小心斜放在展开瓶中盖好盖，观察展开剂通过毛细管作用沿板上 行。此时溶剂上行很快,必须留心观察。当展开剂上行至距离涂层顶端约5mm 时，将板小心取出,用铅笔做好溶剂前沿的位置记号。样点各组分随展开剂上行 同时被展开在各个部位而形成各个有色斑点，取斑点的中心位置做好记号。如果 斑点没
10、有颜色就用显色法使斑点显示出来。一种是在色谱缸中或密闭的容器中放 入几粒碘，把展开后的薄层板放入，待斑点明显时取出做好记号。另一种是带有 荧光的硅胶可用紫外灯照射观察斑点。2菠菜叶色素的提取与分离(1)菠菜色素的提取将菠菜叶洗净,甩去叶面上的水珠，摊在通风橱中抽风干燥至叶面无水迹。称取20g ,用剪刀剪碎,置于研钵中,加入20mL甲醇，研磨5分钟,转入布 氏漏斗中抽滤，保留滤液。将布氏漏斗中的糊状物放回研钵，加入体积比为3:2的石油醯一甲醇混合液20 mL ,研磨，抽滤。用另一份20mL混合液重复操作,抽干。合并两次的滤液, 转入分液漏斗，每次用10mL水洗涤两次,弃去水一醇层,将石油醛层用无
11、水 硫酸钠干燥后滤入蒸催瓶中，水浴加热蒸催至剩约ImL残液。（2）薄层层析铺制竣甲基纤维素钠硅胶板6块，点样，用体积比为8:2的石油醯-丙酮混 合液作展开剂，展开后计算各样点的Rf值,观察各色带样点是否单一,以认定 柱中分离是否完全。建议按下表次序点样。薄板序号二三四五六样点序号12345678910点样物质原提取液原提取液原提取液B-Z7-+-原提取液第二7-r -+4+- 色帀原提取液第三/-I -+-原提取液翁四/-I -+-备补各样点的Rf值因薄层厚度及活化程度不同而略有差异。大致次序为,第一 色带犷胡萝卜素（橙黄色,Rfu0.75）;第二色带叶黄素（黄色，Re0.7）；第三 色带叶绿素a（蓝绿色,R 0.67）;第四色带叶绿素b（黄绿色，Rs 0.50）。在原 提取液（浓缩）的薄层板上还可以看到另一个未知色素的斑点（Rf。0.20）。六. 注意事项七. 成功关代思考题1.试比较叶绿素、叶黄素和胡萝卜素三种色素的极性，为什么胡萝卜素在 薄惑上移动最快?2 .如何利用Rf值来鉴定化合物?3展开剂的高度超过点样线，对薄层色谱有什么影响？