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1、LW-1,电子传递链 与氧化磷酸化, 线粒体中的电子转移反应, ATP合成(氧化磷酸化偶联), 氧化磷酸化的调节,ATP synthase, 氧化磷酸化是好氧生物产能代谢的最终步骤,所有营养物的氧化分解都汇聚到这一细胞呼吸的最后阶段：用NADH/FADH2提供的e将O2还原成H2O，并由氧化能驱动ATP的合成, 线粒体是真核生物进行氧化磷酸化的细胞器,- 内膜对大多数代谢物(包括H+)都不通透， 需经由特殊载体转运,- 呼吸链各组分和ATP合酶均分布在内膜上, 氧化磷酸化机制的解释主要基于化学渗透假说,伴随e传递形成的H+跨膜梯度是所有生物氧化反应中所获能量的储库 (Peter Mitchel
2、l, 1961),LW-2,Electron transport and ATP generation: overview,- 沿内膜结合的载体链 传递e流- 放能性的e流与吸能 性的H+跨膜转运偶联- H+顺梯度的跨膜回流 提供自由能合成ATP,P34-2,氧化磷酸化 = e传递与ATP合成偶联,Matrix,(cf. p324),- 外膜对小分子和离子通透 (膜孔蛋白跨膜通道)- 内膜不通透(包括H+) 含有e传递链组分和ATP合酶- 丙酮酸等中间代谢物可经由特 殊载体进入基质继续氧化(TAC)- ATP被转运到胞液时ADP和Pi 同时进入基质,19-1,氧化磷酸化组分,线粒体生化反应结构
3、模式,膜孔蛋白通道,嵴,1. 线粒体中的电子转移反应, 电子被汇集于通用电子受体- 烟酰胺核苷酸NAD(P)+ (H)- 黄素核苷酸FMN/FAD (12 e),t19-1,(usu. as e receptor in catabolism),(usu. as e donor in anabolism),自学,电子载体大多是具有辅因子的整合蛋白， 能够接受或给出12 e： - e直接转移 (eg. Fe3+ Fe2+) - 以H (H+ + e) 形式转移 - 以H 形式转移还原当量在氧-还反应中转移的单电子当量其他具有电子传递功能的分子 (cf. p330) - Fe-S蛋白 (iron-s
4、ulfur proteins) - 泛醌 (ubiquinone, Q/CoQ) - 细胞色素 (cytochromes, Cyt.),LW-3, 电子流经一系列膜结合的载体传递, 铁-硫蛋白的Fe-S中心,2Fe-2S型,4Fe-4S型,参与单电子转移： Fe-S簇中只有1个Fe被氧化或还原,蓝细菌Anabaena 7120的铁氧还蛋白为2Fe-2S型,19-5 (3rd),仅指无机S,自学,- 完全还原需要2H，经由 半醌基中间物形式以两步 反应完成- 质体醌(叶绿体)和甲基萘 醌(细菌)也具有类似的在 膜结合e传递链中携带e 的功能- 为脂溶性小分子，能在 线粒体内膜的脂双层中 自由扩散
5、，从而在内膜 上其他移动性较低的e 载体间传递还原当量- 既能携带e也能携带H+， 在e流和H+移动的偶联 中具有关键作用, 泛醌 (Q/CoQ),19-2,泛醌,半醌(自由基),泛醇,= 带有长异戊二烯侧链的苯醌,自学, 细胞色素类辅基 (Cyt),- 铁原卟啉存在于 Cyt b类，包括 Hb和Mb,- Cyt a类的血红素A 具有一个连接于五元 环的类异戊二烯长链,- 血红素C通过硫醚键 共价结合于Cyt c类 的两个Cys残基上,19-3,吡咯环,- 由4个五元含氮吡咯环 组成(卟啉)，4 N均以 配位键与中心的Fe (Fe2+/Fe3+)衔接,自学,19-4,还原态细胞色素(Fe2+)
6、都具有三条可见光吸收带，其中波长最长的带分别约为：- cyt a: 600 nm- cyt b: 560 nm- cyt c: 550 nm,Cyt的可见光吸收均与其卟啉环的共轭双键系统有关,自学, 确定电子载体顺序的一般方法,- 测定各载体的Eo- 测定各载体被氧化的速率- 测定各载体的氧-还状态,呼吸链及其相关电子载体的标准还原电势,由Eo推断的载体顺序(non-overstep)：NADH Q cyt b cyt c1 cyt c cyt a cyt a3 O2,e趋向于自发从Eo较低的载体流向较高的,t19-2,提供O2和e供体时，不同阻断剂将导致形成特定的氧化态/还原态载体组合模式(
7、ie. 吸收光谱变化)- 阻断部位之前均为还原态- 阻断部位之后均为氧化态, 电子转移阻断剂对各载体氧-还状态的影响,鱼藤酮,抗霉素A,19-6, 呼吸链若干位点的自由能释放足以推动H+泵,P34-6,自学,毛地黄皂苷处理,渗透破碎,去垢剂溶解处理和离子交换层析,复合体& ATP合酶,19-7 (3rd),In vitro, ATP synthase = ATPase, no ATP-synthesizing activity, 呼吸链功能复合体的分离提纯(cf. p333),自学,- 两类呼吸链组成不同- 泛醌是两类呼吸链的汇合点- 产生ATP的数量不同,(95%),复合体(NADH-Q氧化
8、还原酶),复合体 (琥珀酸-Q还原酶),复合体 (细胞色素还原酶),复合体(细胞色素氧化酶), 电子传递/呼吸链的主要类型,(cf. Fig. 12-6),e转移能量被有效保存在H+梯度中,- e经由复合体/传给Q生成QH2- 作为e和H+的移动载体，QH2随即将e传递给复合体- 复合体再将e转移给另一移动载体Cyt c- 复合体最终将e从Cyt c传递给O2生成H2O- 伴随e流动的同时发生从基质到膜间腔的H+净流动,总矢量反应式(NADH型)NADH + 11HN+ + O2 NAD+ + 10HP+ + H2O,Eo = 0.816V,Eo = 1.14VGo-220 kJ/mol(cf
9、. p335), 呼吸链四个复合体的e和H+流,19-15,Eo = -0.32V,(Eo = 0.031V),(cf. Fig. 12-11 12-15),Eo = 0.045V, 电子载体以多酶 复合体形式进行反应,电子从NADH、琥珀酸、脂酰-CoA和甘油-3-P到泛醌(Q)的传递途径,甘油-3-P脱氢酶,NADH型呼吸链(95%)起点为脱氢酶辅酶NAD+,酰基-CoA脱氢酶,氧化还原酶,19-8,FADH2型呼吸链起点为脱氢酶辅因子FAD,自学, 复合体(NADH:Q氧化还原酶),- 催化:H从NADH转移 至FMN- FMN经由系列Fe-S中 心将2e传递给基质臂 上的Fe-S蛋白N
10、-2- 2e沿膜臂从N-2转移 到Q后形成QH2- QH2扩散进入膜脂双 层(III)，同时驱动 4H+从基质中排出- 阿密妥、鱼藤酮和杀 粉蝶菌素A能抑制该 电子流而完全阻断氧 化磷酸化的进行,膜间腔,基质臂,膜臂,19-9,矢量H+流产生跨内膜的电化学势能，使e传递中释出的大部分能量得以储存，而H+的回流则可用于驱动ATP的合成,NADH + 5HN+ + Q NAD+ + QH2 + 4HP+,= NADH Q,自学, 复合体 (琥珀酸脱氢酶),- 异型四亚基 (五辅基),膜整合蛋白,辅基,周质心磷脂,- 从琥珀酸结合位点 经FAD和Fe-S中心 至Q结合位点的e 转移通道全长超过 40
11、，但每一段均 短于快速e 转移的 共振距离11,19-10,= 琥珀酸 Q,for E. coli,自学, 复合体 (细胞色素bc1复合体),- 为同型二聚体，各 单体由11个不同的 亚基组成- 单体的功能核心为 三个关键亚基： 含有2 heme的cyt b 含有heme的cyt c1 含有2Fe-2S中心的 Rieske Fe-S蛋白,19-11a,= Q cyt c,其中Fe结合于His而不是Cys,自学, 复合体的二聚体作用,- 凸出在P侧的cyt c1 和Rieske Fe-S蛋白 可以和膜间腔中的 游离cyt c 相互作用- 2个独立的Q结合点 QN和QP分别与能阻 断氧化磷酸化的两
12、种 药物抑制作用有关- Q中间代谢物的移动 发生在单体之间形成 的空隙中,抗霉素A可与之结合而阻断电子从血红素bH Q,黏噻唑菌醇可与之结合而阻断电子从QH2 F-S中心,19-11b,自学, Q cycle,1st e,2nd e,19-12,= 完成双/单电子载体之间的转换,可溶性蛋白，还原后即可向复合体挪动,膜间腔H+净增,自学,G21.12,泛醌-泛醇库,半醌不解脱,自学,19-13, 复合体(细胞色素氧化酶),= cyt c O2,10个亚基中以构建复合体核心,- 亚基含血红素a & a3和铜离子 CuB，形成双核Fe-Cu中心,- 亚基含有2个铜离子，分别与 2 Cys-SH连接成
13、双核中心CuA,- 双核中心CuA的2个铜离子 均等共享1e： 还原态为Cu1+Cu1+ 氧化态为Cu1.5+Cu1.5+,- 亚基为复合体功能所必需， 但作用不详,Met,His,Asp,Cys,自学,以底物方式消耗,- O2的还原需要4e + 4H+ (= 2 NADH当量)- cyt cO2的e传递分两轮 进展： 1st轮的2e将O2还原成O22- 2nd轮的2e再将O22-还原成 H2O (消耗基质中的4H+)- 每个e通过时还可泵出1H+, 复合体的作用机制,19-14,- 总反应：4 cyt c(还原态) + 8HN+ + O2 4 cyt c(氧化态) + 4HP+ + 2H2O
14、,CN, N3, CO可抑制,自学,只有还原态双核中心Fea32+-CuB+ 才能接受O2，并分别由Fea32+和CuB+ 各提供e将其还原为过氧化中间物,cyt c提供的3rd e将 CuB2+再还原成CuB+,靠近CuB+的O被质子化 而引起e重新分布,加上2nd H+和4th e后，导致 O-O键断裂并形成羟化中间物,再加上2 H+后释出2 H2O， 双核中心返回氧化态,氧化态双核中心Fea33+-CuB2+ 被来自cyt c的2e分步还原,P34-8, 复合体还原O2的假设机制,尚未完全还原的过氧化态中间物始终与复合体紧密结合，直到完全还原成H2O才释出,O22,自学,19-16,线粒
15、体内膜将两个不同的H+区室分开，形成跨膜的化学浓度差(pH)和电位差()，其净效应即是PMF, 质子动势(PMF: proton motive force)= e传递中释出的大部分能量的暂时储存形式,生理条件下泵出H+的G20 kJ/mol,G21.22,(cf. p341),Eastern skunk cabbage, 植物线粒体氧化 NADH的不同机制,- 低照明时可通过类似于非光合物种的 e流传递机制以合成ATP- 光照下其线粒体的NADH主要来自于 光呼吸产生的Gly缩合成Ser 2 Gly + NAD+ Ser + NADH + H+ + CO2 + NH4+,不受CN抑制,b19-
16、1,绕过、和及其H+泵，将能量直接以热形式耗散以再生出光呼吸所需的NAD+,自学,19-16 (3rd),- 来自于NADH等可氧 化底物的e通过内膜 上的载体而传递- e流伴随有H+的跨膜 转移而形成化学梯度 和电位梯度(=PMF)- 内膜对H+不通透，只 能经由特异通道(Fo) 返回基质- 驱动H+返回的PMF为 ATP的合成提供能量， 该偶联反应由结合于 Fo的F1复合体所催化,内碱外酸,在与e传递相偶联所形成的PMF驱动下，泵入膜间腔的H+经由特殊通道回流至基质，而由此产生的G被用于将ADP + Pi ATP,内负外正,ATP合酶,chemiosmotic hypothesis (19
17、61),2. ATP合成,1978 NP in Chem.,- 只添加ADP和Pi时， 呼吸(O2耗)和ATP 合成都很小- 添加e供体如琥珀酸 则立即显著增加- 加入氰化物后又随即 被抑制, 电子传递和ATP合成相偶联,19-18,- 已加入琥珀酸的线粒体，其呼吸 和ATP合成只有在添加ADP和Pi 之后才能进行- 氧化磷酸化抑制剂杀黑星霉素/寡 霉素可因阻断ATP的合成而抑制 呼吸的进行- 解偶联剂2,4-二硝基苯酚(DNP) 使呼吸继续进行但不能合成ATP,干扰ATP合酶使其合成受阻 H+不能返回基质 H+梯度加大导致H+泵停转 e流停止,Cyt (a+a3) O2,G21.31,2,4
18、-二硝基苯酚 (DNP),- 疏水性小分子(弱酸)- 具有可解离H+- 不影响e传递和H+泵- 可携带H+跨越内膜而 破坏其跨膜梯度，进 而抑制ATP合成,使e传递和ATP合成相互分离, 解偶联剂 (uncoupler),Dinitrophenol,电子离域作用使负电荷相应分散，导致该阴离子表现为弱脂溶性的,双(羟)香豆素,通过提供H+重返基质的另一条途径，褐色脂肪组织线粒体的解偶联蛋白/产热素蛋白使质子泵保存的能量以热量形式发散出来, 解偶联线粒体的产热反应,19-30,自学,- 将线粒体悬浮于0.1M KCl的pH 9 缓冲液，经由渗透作用最终使基质 与环境达到平衡- 将线粒体移至pH 7
19、缓冲液，后者 含有K+载体缬氨霉素但不含KCl- 缓冲液的改变使线粒体内膜两侧 形成2 pH单位差(内碱外酸)- K+在缬氨霉素载运下顺其梯度外泄 导致跨膜电荷不平衡(内负外正)- 两者形成的电化学势即为质子动势 PMF，足以在缺乏可氧化底物提供 e流的条件下使ATP的合成进行, ATP合成中质子梯度作用的证实人工模拟的电化学梯度能够在缺乏可氧化底物作为电子供体的条件下驱动ATP的合成,19-20,自学,F1= 33 (膜周蛋白)Fo= ab2c1012 (膜整合蛋白),转轴, ATP合酶结构 (= FoF1复合体),- Fo是跨内膜疏水蛋白组成的H+孔 道，2b2亚基与F1的及亚基紧 密结合
20、而使之相对固定在内膜上- 嵌合在膜内的c亚基柱状体环绕 由F1的及亚基所组成的主茎- H+经由Fo从P侧跨膜流向N侧时， 柱状体和主茎即发生相对旋转， 使F1的亚基依次与亚基接触 而改变其构象,19-23f,自学,(cf. Fig. 12-17),松散构象,开放构象,紧密构象,每个亚基在与其相邻的亚基交界处都有一个对催化活性极为关键的腺苷酸结合位点，但在任一给定时刻均分别处于不同构象- 紧密构象结合有 已合成的ATP- 松散构象与 ADP & Pi结合- 开放构象为空载, F1的晶体结构顶视图(膜N侧),转轴亚基,19-23c,自学,- F1复合体具有3个不同的腺苷酸结合 位点，分别对应于一对
21、亚基， 但在任一给定时刻分别呈现紧密、 松散和空载构象- PMF使主茎带动亚基转动(120 跳跃式)，依次与各对亚基 接触，导致相互协调的构象变化： -ATP位点转化成空载构象而 释出ATP(需要3 H+进入基质) -ADP位点变为紧密构象，促进 松散结合的ADP和Pi缩合成ATP -empty位点转变成松散构象， 使进入的ADP和Pi松散结合- 3个催化位点中至少有2个交替处于 活性状态( = 只有当某个位点结合了 ADP和Pi时，另一位点才能释出ATP), ATP合酶作用的结合-变换机制- 旋转催化(1979), NP in Chem. 2019,19-24,1918,(cf. Fig.
22、12-19),- 腺苷酸移位酶是逆向转运 载体，而外正内负的跨膜 电位差有利于该逆向主动 转运的进行(ADP3取代 ATP4意味着负电荷的 净流出)- 磷酸移位酶是同向转运载 体，仅对H2PO4专注，后 者与H+的同向内流不会造 成净电荷移动，但基质内 的低H+有助于同向转运, 质子动势亦可驱动主动转运,(腺苷酸及磷酸移位酶),19-26,PMF既可为ATP合成提供能量，也能促进将底物ADP+Pi和产物ATP分别转入和转出基质的主动转运,(cf. Fig. 12-5),19-27, 胞液NADH的再氧化：穿梭机制,苹果酸-天冬氨酸穿梭(肝、肾及心肌细胞),(= 将胞液中产生的NADH 当量转入
23、线粒体基质),胞液NADH 将2个还原当量转给草酰乙酸生成苹果酸,苹果酸在苹果酸-酮戊二酸转运蛋白作用下跨越内膜,苹果酸在基质中将还原当量转移给NAD+、生成NADH并经由呼吸链继续氧化,苹果酸脱氢生成的草酰乙酸不能直接返回胞液，需经由转氨反应生成Asp,Asp经由Glu-Asp转运蛋白返回胞液,Asp再通过转氨反应再生草酰乙酸,(cf. Fig. 12-3),- 在胞液甘油-3-P脱氢酶 (辅酶NADH)作用下， 二羟丙酮磷酸接受2个 还原当量生成甘油-3-P- 结合在线粒体内膜外表 面的甘油-3-P脱氢酶 (辅因子为FAD的线粒体 同工酶)随即将这2个还 原当量转移给泛醌并继 续经由呼吸链
24、传递- 该穿梭使胞液NADH 还原当量的传递因绕 过呼吸链的复合体 而少泵出4 H+,甘油-3-P穿梭(骨骼肌及脑细胞),19-28,(cf. Fig. 12-4),t19-5,- 复合体、和 在传递2e时分别 从基质泵出4/4/2H+ 即NADH型链和 FADH2型链总共可 分别泵出10/6 H+- 每合成1 ATP需要 回流4 H+：3个用于 合成，1个用于与 ATP等转运有关的 反响- NADH型和FADH2 型链每传递2e给 O2可以分别合成 2.5/1.5 ATP,细胞条件下ATP水解的Go-50 kJ/mol，合成32个ATP将保存Glc完全氧化释放总能量的54%, 葡萄糖彻底氧化
25、时的ATP合成总结算,19-31,= ATP、ADP/AMP和NADH 相对浓度的变化对糖酵解、 丙酮酸氧化脱羧、柠檬酸循 环和氧化磷酸化的连锁调节 - 高能态抑制 - 低能态促进,3. 氧化磷酸化调节,G21.30, 电子传递及氧化磷酸化的常见抑制剂作用部位,二环己基碳二亚胺寡霉素,解偶联剂：2,4-二硝基苯酚双(羟)香豆素氟羰氰苯腙,鱼藤酮蝶啶阿密妥汞制剂地美露,噻吩甲酰三氟丙酮萎锈灵,抗霉素,氰化物叠氮化物CO,自学,(cf. p338, 342 & 344),小结：电子传递链与氧化磷酸化, 化学渗透假说为氧化磷酸化的能量偶联机制研究 提供了框架：e流能量以同时泵送H+跨膜移动的 方式被
26、储存，即产生相应的电化学梯度质子动势, 在线粒体中，各种NAD关联的脱氢酶经由穿梭系统 从底物移除的:H将e提供给呼吸链，并通过后者将 其最终传递给O2而还原成H2O, 呼吸链由蛋白质和辅因子构建的复合体组成， e依据其还原电势依次转移：来自NADH的经由复 合体、和引入，来自琥珀酸的则通过复合体 ；参与e转移的辅因子包括FMN、FAD、Fe-S 蔟、Cu、cyt和泛醌,LW-4, e经由复合体、和的传递会导致H+跨线粒体 内膜外泵，使得基质相对于膜间腔偏碱，而由此产 生的H+梯度即可以PMF方式提供能量，使内膜上的 ATP合酶(FoF1复合体)以ADP和Pi合成ATP, ATP合酶以旋转催化
27、方式运行：流经Fo的H+流使F1 的三个核苷酸结合位点依次转化成-(ADP + Pi)、 -ATP以及-空载构象, e经由复合体或CoQ进入呼吸链时，每 O2还原 为H2O所合成的ATP数(P/O比)分别为2.5和1.5, 通过对呼吸、糖酵解和柠檬酸循环等途径的一系列 连锁调控，ATP和ADP的相对浓度(细胞能态)可以 协调呼吸链的反应强度,LW-5,复习题 (p130),一、选择 1, 5, 911, 13, 16, 19 22, 26, 29, 31, 32二、填空 4, 6, 911, 1517, 19 2527, 31, 32三、名词解释 16四、判别 6, 7, 9, 13, 15, 20, 21五、问答 2, 6, 7,作 业 1. 电子传递链中各成员是 依据什么原则排列的？2. 简述电子传递链与氧化 磷酸化之间的关系3. 在一个具有全部细胞功 能的哺乳动物细胞匀浆 中分别加入葡萄糖、丙 酮酸和柠檬酸，当其完 全氧化为CO2和H2O时 各能产生多少ATP？ (需要给出各反应步骤!),