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1、附件6:辅助降血脂功能评价方法试验工程、试验原那么及结果判定Items, Principles and Result Assessment根据血脂异常的类型,辅助降血脂功能根据不同的血脂类型设立分类的动物试验和人 体试食实验.1试验工程1.1根据受试样品的作用机制,分成三种情况1.1.1辅助降低血脂功能：降低血清总胆固醇和血清甘油三酯1.1.2辅助降低血清胆固醇功能：单纯降低血清胆固醇1.1.3辅助降低血清甘油三酯功能：单纯降低血清甘油三酯1.2观察指标1.2.1体重1.2.2血清总胆固醇1.2.3血清甘油三酯1.2.4血清高密度脂蛋白胆固醇1.2.5血清低密度脂蛋白胆固醇1.3人体试食试验1
2、.3.1血清总胆固醇1.3.2血清甘油三酯1.3.3血清高密度脂蛋白胆固醇1.3.4.血清低密度脂蛋白胆固醇2试验原那么2.1动物实验和人体试食试验所列指标均为必测工程.2.2根据受试样品的作用机制,可在动物实验的两个动物模型中任选一项.2.3根据受试样品的作用机制,可在人体试食试验的三个方案中任选一项.2.4在进行人体试食试验时,应对受试样品的食用平安性作进一步的观察.3结果判定3.1动物实验：3.1.1混合型高脂血症动物模型血清辅助降低血脂功能结果判定：模型对照组和空白对照组比拟,血清甘油三酯升高总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇升高,差异均有显著性,判定模型成立.1各剂量组与模型对照组比拟,任
3、一剂量组血清总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇降低,且任一剂量组血清甘油三酯降低,差异均有显著性,同时各剂量组血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于模型对 照组,可判定该受试样品辅助降低血脂功能动物实验结果阳性.2各剂量组与模型对照组比拟,任一剂量组血清总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇降低,差异均有显著性,同时各剂量组血清甘油三酯不显著高于模型对照组,各剂量组血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于模型对照组,可判定该受试样品辅助降低血清胆固醇功能动物实验结果阳性.3各剂量组与模型对照组比拟, 任一剂量组血清甘油三酯降低,差异均有显著性,同时各剂量组血清总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇不显著高于模型对照组,血清高密度脂蛋
4、白胆固醇不显著低于模型对照组,可判定该受试样品辅助降低血清甘油三酯功能动物实验结果阳性.3.1.2高胆固醇血症动物模型模型对照组和空白对照组比拟,血清总胆固醇TC或低密度脂蛋白胆固醇 LDL-C升高,血清甘油三酯TG差异无显著性,判定模型成立.各剂量组与模型对照组比拟, 任一剂量组血清总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇降低,差异有显著性,并且各剂量组血清高密度脂蛋白胆固醇HDL-C 不显著低于模型对照组,血清甘油三酯不显著高于模型对照 组,可判定该受试样品辅助降低血清胆固醇功能动物实验结果阳性.3.2人体试食试验 指标判定标准： 有效：TC 降低10%; TG 降低 15%; HDL-C 上升 0.
5、104mmol/L. 无效：未到达有效标准者.3.2.1辅助降低血脂功能结果判定试食组自身比拟及试食组与对照组组间比拟,受试者血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇降低, 差异均有显著性,同时血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于对照组,试验组总有效率显著高于对照组,可判定该受试样品辅助降低血脂功能人体试食试验结果阳 性.3.2.2辅助降低血清胆固醇功能结果判定试食组自身比拟及试食组与对照组组间比拟,受试者血清总胆固醇、 低密度脂蛋白胆固醇降低,差异均有显著性,同时血清甘油三酯不显著高于对照组, 血清高密度脂蛋白胆固醇 不显著低于对照组,试验组血清总胆固醇有效率显著高于对照组,可判定该受试样品辅
6、助降低血脂功能人体试食试验结果阳性.3.2.3辅助降低甘油三酯功能结果判定试食组自身比拟及试食组与对照组组间比拟,受试者血清甘油三酯降低,差异有显著性,同时血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇不显著高于对照组,血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于对照组,试验组血清甘油三酯有效率显著高于对照组,可判定该受试样品辅助降低甘油三酯功能人体试食试验结果阳性.辅助降低血脂功能检验方法Method for the Assessment of Assisting BloodLipids Reduction Function根据血脂异常的类型,辅助降低血脂功能根据受试物作用机制的不同,设立分类的动 物试验.动物试验：
7、分成二种情况：1. 混合型高酯血症动物模型2. 高胆固醇血症动物模型人体试食试验：根据试验的结果,分三种情况分别进行判定：1. 辅助降低血脂功能2. 辅助降低血清胆固醇功能3. 辅助降低甘油三酯功能1动物实验检验方法1.1混合型高脂血症动物模型1.1.1原理用含有胆固醇、蔗糖、猪油、胆酸钠的饲料喂养动物可形成脂代谢紊乱动物模型,再给予动物受试样品,可检测受试样品对高脂血症的影响,并可判定受试样品对脂质的吸收、脂蛋白的形成、脂质的降解或排泄产生的影响.1.1.2仪器及试剂解剖器械、分光光度计,自动生化分析仪,胆固醇、胆酸钠、血清总胆固醇TC、甘油三酯TG、低密度脂蛋白胆固醇LDL-C ,高密度脂
8、蛋白胆固醇HDL-C 测定 试剂盒.1.1.3动物选择及饲料1.1.3.1健康成年雄性大鼠,适应期结束时,体重200 0g,首选SD大鼠,每组8- 12只.1.1.3.2模型饲料在维持饲料中添加 20.0 %蔗糖、15%猪油、1.2 %胆固醇、0.2%胆酸钠,适量的酪蛋白、 磷酸氢钙、石粉等.除了粗脂肪外,模型饲料的水分、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、 钙、磷、钙：磷均要到达维持饲料的国家标准.1.1.4剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组、空白对照组和模型对照组,以人体推荐量的5倍为其中的一个剂量组,另设二个剂量组,必要时设阳性对照组.受试样品给予时间为30天,必要时可延长至45天.
9、1.1.5实验步骤1.1.5.1适应期：于屏障系统下大鼠喂饲维持饲料观察5 - 7天.1.1.5.2造模期按体重随机分成2组,10只大鼠给予维持饲料作为空白对照组,40只给予模型饲料作为模型对照组.每周称量体重1次.模型对照组给予模型饲料1-2周后,空白对照组和模型对照组大鼠不禁食采血眼内眦或尾部,采血后尽快别离血清,测定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平.根据TC水平将模型对照组随机分成 4组,分组后空白对照组和模型对照组比拟TC、TG、LDL-C、HDL-C差异均无显著性.1.1.5.3受试样品给予分组后,三个剂量组每天经 -口给予受试样品,空白对照组和模型对照组同时给予同体 积的
10、相应溶剂,空白对照组继续给予维持饲料,模型对照组及三个剂量组继续给予模型饲料,并定期称量体重,于实验结束时不禁食采血,采血后尽快别离血清,测定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平.1.1.6 观察指标：TC、TG、LDL-C 、HDL-C.1.1.7数据处理和结果判定一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,36F值F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值F.05, PW 0.05用多个实验组和一个对照组间均数的两两比拟方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换, 待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计；假设变量转换后仍未
11、到达正态或方差 齐的目的,改用秩和检验进行统计.动物实验结果判定：辅助降低血脂功能结果判定：模型对照组和空白对照组比拟,血清甘油三酯升高,血清总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇升高,差异均有显著性,判定模型成立.1各剂量组与模型对照组比拟,任一剂量组血清总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇降低,且任一剂量组血清甘油三酯降低,差异均有显著性,同时各剂量组血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于模型对 照组,可判定该受试样品辅助降低血脂功能动物实验结果阳性.2各剂量组与模型对照组比拟,任一剂量组血清总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇降低,差异均有显著性,同时各剂量组血清甘油三酯不显著高于模型对照组,各剂量组血清高密度脂蛋白胆
12、固醇不显著低于模型对照组,可判定该受试样品辅助降低胆固醇功能动物实验结果阳性.3各剂量组与模型对照组比拟,任一剂量组血清甘油三酯降低,差异均有显著性,同时各剂量组血清总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇不显著高于模型对照组,血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于模型对照组,可判定该受试样品辅助降低甘油三酯功能动物实验结果阳性.1.1.8考前须知1.1.8.1在建立动物模型中,可因动物品系、饲养治理而影响模型的建立.1.182保证维持饲料的各种营养成分,必要时需进行检测,除了粗脂肪外,模型饲料的水 分、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、钙、磷、钙：磷均要到达维持饲料的国家标准.1.183模型饲料喂养期间,模型组
13、血中胆固醇水平比拟稳定,甘油三酯水平会逐渐恢复正 常水平,故模型饲料给予时间不能超过8周.1.2高胆固醇血症动物模型1.2.1原理用含有胆固醇、猪油、胆酸钠的饲料喂养动物可形成高胆固醇脂代谢紊乱动物模型,再给予动物受试样品,可检测受试样品对高胆固醇脂血症的影响,并可判定受试样品对脂质的吸收、脂蛋白的形成、脂质的降解或排泄产生的影响.1.2.2仪器及试剂解剖器械、分光光度计,自动生化分析仪,胆固醇、胆酸钠、血清总胆固醇TC、甘油三酯TG、低密度脂蛋白胆固醇LDL-C ,高密度脂蛋白胆固醇HDL-C 测定 试剂盒.1.2.3动物选择及饲料1.2.3.1大鼠模型：健康成年雄性大鼠,适应期结束时,体重
14、200翌Og,首选SD种大鼠,每组8 12只.金黄地鼠模型：健康成年雄性金黄地鼠,适应期结束时,体重10010g,每组8 12只.1.2.3.2模型饲料大鼠模型：在维持饲料中添加1.2%胆固醇、0.2%胆酸钠、3-5 %猪油,适量的酪蛋白、磷酸氢钙、石粉等.除了粗脂肪外,模型饲料的其它质量指标均要到达维持饲料的国家标准.金黄地鼠模型：在维持饲料中添加0.2%胆固醇,其余同大鼠模型.1.2.4剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组、空白对照组和模型对照组,以人体推荐量的5倍为其中的一个剂量组,另设二个剂量组,必要时设阳性对照组.受试样品给予时间为30天,必要时可延长至45天.1.2.5实验步
15、骤1.2.5.1适应期：于屏障系统下动物喂饲维持饲料观察5 7天.1.2.5.2造模期：按体重随机分成2组,10只动物给予维持饲料作为空白对照组,40只给予模型饲料作为模型对照组.每周称量体重1次.模型对照组给予模型饲料 1-2周后,空白对照组和模型对照组动物不禁食采血眼内眦或尾部,采血后尽快别离血清,测定血清 TC、TG、LDL-C、HDL-C水平.根据TC水平 将模型对照组随机分成 4组,分组后空白对照组和模型对照组比拟 TC、TG、LDL-C、HDL-C 差异均无显著性P0.05.125.3受试样品给予分组后,三个剂量组每天经口给予受试样品,空白对照组和模型对照组同时给予同体积的相应溶剂
16、,空白对照组继续给予维持饲料,模型对照组及三个剂量组继续给予模型饲料, 并定期称量体重,于实验结束时不禁食采血,采血后尽快别离血清,测定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平.1.2.6 观察指标：TC、TG、LDL-C 、HDL-C.1.2.7数据处理和结果判定一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,36F值10%; TG 降低 15%; HDL-C 上升 0.104mmol/L.无效：未到达有效标准者.观察血清总胆固醇TC有效率、甘油三酯TG有效率、高密度脂蛋白胆固醇HDL-C 有效率及总有效率.2.6数据处理和结果判定凡自身对照资料可以采用配对t
17、检验,两组均数比拟采用成组t检验,后者需进行方差齐性检验,对非正态分布或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态方差齐后, 用转换的数据进行t检验；假设转换数据仍不能满足正态方差齐要求,改用t检验或秩和检验；方差齐方但变异系数太大如 CV50 %的资料应用秩和检验.有效率及总有效率采用X2检验进行检验.四格表总例数小于40,或总例数等于或大于 40但出现理论数等于或小于1时,应改用确切概率法.2.6.1辅助降低血脂功能结果判定：试食组自身比拟及试食组与对照组组间比拟,受试者血清总胆固醇、 甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇降低, 差异均有显著性,同时血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于对照组,试验组
18、总有效率显著高于对照组,可判定该受试样品辅助降低血脂功能人体试食试验结果阳 性.2.6.2辅助降低血清胆固醇功能结果判定：试食组自身比拟及试食组与对照组组间比拟, 受试者血清总胆固醇、 低密度脂蛋白胆固 醇降低,差异均有显著性,同时血清甘油三酯不显著高于对照组, 血清高密度脂蛋白胆固醇 不显著低于对照组,试验组血清总胆固醇有效率显著高于对照组, 可判定该受试样品辅助降 低血脂功能人体试食试验结果阳性.2.6.3辅助降低甘油三酯功能结果判定:试食组自身比拟及试食组与对照组组间比拟,受试者血清甘油三酯降低, 差异有显著性,同时血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇不显著高于对照组,血清高密度脂蛋白胆固醇不显可判定该受试样品辅助降低甘著低于对照组,试验组血清甘油三酯有效率显著高于对照组, 油三酯功能人体试食试验结果阳性.