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1、学号 2007218018昆明理工大学硕士研究生综述专业 微牛物学姓名贾衽入学时间2007年9月日期2009年1月8日CcdB分子生物学研究进展摘要：毒素-抗毒素系统广泛存在于质粒及大肠杆菌染色体中，在缺乏抗毒素的情况下， 毒素通过作用于细胞内不同的酶，使细胞中毒，最终导致细胞死亡。本文综述了ccd系统及自杀基因ccdB的作用原理和机制。关键词：毒素-抗毒素系统、Ccd系统、CcdBKey words: Toxin-antitoxin system, Ccd system, CcdB毒素-抗毒素（Toxin-antitoxin, TQ 系统是一一种可能与细胞生长阻滞或是细胞凋亡有 关的系统。该
2、系统最初发现存在于大肠杆菌 F质粒上1,典型的T粽统由两个基因构成。 两个基因分别编码一种稳定的毒素蛋白和一种不稳定的抗毒素蛋白，毒素对细菌有致死 作用，而抗毒素通过与毒素形成复合体，中和毒素的毒性，使宿主菌能够存活。T粽统主要存在于一些低拷贝质粒上，细菌分裂后，不稳定的抗毒素蛋白被迅速降 解，不具有质粒的子代细菌就会被稳定的毒素蛋白杀死，这种作用称为分裂后致死效应 （the post segregation killing effect, PSK,近一步研究发现在大肠杆菌的染色体上也存在 TAS统，但染色体上的抗毒素蛋白对毒素蛋白并不能起到解毒的作用，只有依靠质粒上 的抗毒素蛋白才能保证细菌
3、存活，低拷贝质粒正是依靠T惊统的PS瞰应，稳定在宿主中存在。目前已知的丁惊统包括7个质粒编码TA因家族：ccd mazEF vapBC、phd/doc、 parDE、higBA?PrelBE2, 3。虽然T惊统在基因结构和调控模式上十分相似，但是每种毒素 的作用原理却存在很大差异。CcdBffiParEffl过使促旋酶失活抑制DNAfi制，使细胞中毒。 RelES过切割mRNA,抑制翻译过程导致细胞凋亡。而HigB勺作用机理目前尚不清楚。1. Ccd系统Ccd （control of cell division or death）为F质粒小F复制子上的一个组件，F质粒共 编码三种TA基因系统4
4、, Ccd系统5只是其中的一种，由CcdA和CcdB两个基因共同构 成，也可以称为H、G或是letA、letB,分别编码两种小分子量蛋白：CcdA蛋白（8.7kDa） 与CcdB蛋白（11.7 kDa）。CcdA蛋白易被Lon蛋白酶降解，在系统中起到解毒剂的作用， CcdB蛋白较CcdA蛋白稳定，是一种细胞毒素，在没有解毒剂存在的条件下，可以导致 细胞凋亡。CcdB编码一个101个氨基酸的蛋白（图1）,能使DNA促旋酶复合体中毒，并抑制促旋酶的活性。图1 CcdB蛋白二聚体的二级结构拓扑图6红色的为5条反向平行的3一折叠，稍短的3条紫色的为翼型折叠，黄色为 C端的“螺旋。但是，当存在CcdA蛋
5、白时，CcdB蛋白活性因为形成CcdA-CcdB密复合体而受到 一定程度的抑制。3. CcdB蛋白作用原理3.1 促旋酶促旋酶是一种在原核生物有机体中必须存在且高度保守的酶，属于拓扑异构酶II,大肠杆菌促旋酶作为一种罕有的拓扑异构酶，在ATP存在时，能够解除负超螺旋。大肠杆菌促旋酶为四聚体，由两个GyrA亚基（97kDa）和两个GyrB亚基（90kDa）组成。GyrA 亚基有两个功能不同的结构域7,其中N-端结构域（59kDa）与DNA断裂-修复有关，而 C端结构域（37kDa）为DNA结合结构域，与DNA折叠有关，整个GyrA亚基形成酶的催 化中心，与DNA断裂一再接合反应有关。GyrB亚基
6、同样由两个结构域组成，N-端结构域 （43kDa）决定着促旋酶的活性，具作用是结合和水解 ATP, C-端结才域（47kDa）的功能 目前还不清楚网。3.2 CcdB蛋白与促旋酶的相互作用促旋酶通过GyrA亚基上的Tyr122共价结合DNA,并诱发DNA的断裂，断裂的DNA 称为G-segment ,同时，另一条称为 T-segment的完整DNA穿过G-segment的断裂处， 释放到DNA促旋酶复合体以外，G-segment在原断裂处重新被修复。正是通过这样的断 裂一再接合反应，促旋酶不断地向 DNA结构中引入负超螺旋，使基因的转录和复制能够 顺利进行。体外实验证明：CcdB蛋白存在时，促
7、旋酶GyrA亚基和CcdB蛋白直接结合， 形成复合体（a复合体），CcdB蛋白对促旋酶水解ATP和促发超螺旋的能力没有影响， 即对促旋酶没有毒性。但是，当 GyrB亚基存在时，a复合体会缓慢转变为另一种复合体B复合体。B复合体能够水解 ATP但不产生超螺旋，对促旋酶存在毒性。中毒后 的促旋酶使DNA只发生断裂却不能修复，进而减少细胞DNA合成9,激发SOS反应10,形成无核细胞，最终导致细胞凋亡。4. CcdB蛋白作用机制研究表明：大肠杆菌中的CcdB蛋白主要有两种作用：1、捕捉断裂的DNA一促旋酶 复合体并使其中毒；2、造成大肠杆菌T7聚合酶通路的中断110因此，最初的研究者们 认为：Ccd
8、B蛋白的作用机制可能与唾诺酮类药物类似12,即与GyrA的N端区域相互作 用，触发一个快速却不依赖 ATP的，稳定的促旋酶一DNA复合体，诱发DNA损伤，导致 双链断裂13。但是，后来的研究表明CcdB蛋白作用机理较唾诺酮类药物更为复杂。4.1 对能量的依赖性：在从CcdB蛋白使DNA促旋酶中毒，到完成切割线性 DNA的过程中，能量ATP是一 个不可缺少的重要因素14。研究表明：用非水解产物 ATP类似物ADPNP和ADPCP弋替 ATP在CcdB蛋白存在的情况下，并不能促发 CcdB蛋白对DNA的切割作用。通过对促 旋酶进行改造，得到能结合 ATP,但不能使其水解的促旋酶突变体，当 CcdB
9、蛋白作用于 该突变体时，即使存在 ATP也不能促发线性DNA的切割反应。但是，以上现象仅出现在线性 DNA和松弛型闭合环状DNA中，对于负超螺旋DNA 而言，不存在能量上的依赖现象15o4.2 对DNA片段长度的要求在CcdB蛋白介导的DNA切割反应中，DNA片断长度对切割效率有着很大的影响， 最小长度要求为160bp,而唯诺酮类药物可介导切割的双链 DNA片断长度最小为20bp, 但并不是只要大于160bp的DNA都能在CcdB蛋白存在的情况下被切开，相反，CcdB蛋 白，对DNA的切割作用在DNA长度上要求非常严格，原理目前还没有明确的定论。4.3 与促旋酶结合的区域唾诺酮类药物与促旋酶结
10、合的区域为 GyrA亚基第67个氨基酸至106个氨基酸之间 的保守区域（QRDR。GyrA亚基与ccdB蛋白相互作用的位点为 Arg462, GyrA亚基与DNA 共价结合的位点为Tyr122 （图2）。Arg462 Tyrl221477571875qrdrW L ,.1 59 kDa A图2促旋酶GyrA亚基的结构4CcdEg白存在时，DNA的切割作用过程(图3)。(a)在缺乏DNA时，促旋酶处于静止状态，此时的 GyrB夹子是开放的；(b)第一段DNA( G segment)能够与静止期的酶反向结合；(c) G片断(G segment:)断裂，断裂的两部分仍然以共价键结合到 GyrA亚基酪
11、氨 酸残基活性位点Tyr122上，形成所谓的切割复合体。第二段 DNA片断(T segment)进入 到GyrB夹子；(d) 一旦ATP与促旋酶结合，促旋酶的GyrB夹子立刻关闭。这使得GyrA亚基二聚 体的构象平衡达到其开放式构造。T segment便可以通过G门，DNA增加两个负超螺旋；(e)在T segment通过之前，CcdB蛋白可以与促旋酶结合，但结合之后，G门便不 再关闭，形成切割复合体；而在缺乏CcdB蛋白的条件下，GyrA亚基的主要出口会在瞬间开放来释放Tsegment,随即关闭；(g)在T segment释放过程2束后，ATP被水解，酶又恢复到静止的状态。开始新 一轮超螺旋的
12、形成，或者进行 G segment的选择性连接，使酶释放超螺旋 DNA。图3 CcdB使促旋酶中毒的机制16蓝色：GyrA亚基；绿色： GyrB亚基；红色：DNA链；黄色：CcdB蛋白5 .抗毒素CcdA与毒素ccdB间的相互作用作为Ccd系统抗毒素的CcdA蛋白有两个不同，相互独立的结构域组成：N-端结构域 和C-g结构域。N-端结构域结合DNA,对蛋白的结合不起任何作用，也不会因为蛋白在 其它位点上的结合，而出现结构上的变化；C端结构域则负责同毒素 CcdB蛋白结合】。CcdB与CcdA间的相互作用很复杂，依赖于两者间浓度的比例，产生不同的复合物。当 CcdA与CcdB间的比率大于或等于1
13、时，CcdA二聚体会与CcdB二聚体形成复合体，在体 外表现出很强的DNA结合能力，螺旋环绕在120bp的启动子区域，这时发挥抑制作用。 而当CcdA与CcdB的比例小于1时，就会形成一种由一个 CcdA二聚体与两个CcdB二聚 体形成的复合体，此时没有抑制作用。正是由于CcdA可以高效地结合CcdB,所以，CcdA蛋白可以从无活性的CcdB-GyrA 复合体中夺取CcdB蛋白，从而使GyrA恢复原有的活力。6 . CcdB应用展望由于CcdB寸大肠杆菌促旋酶的强毒性效应，ccdB基因可以被构建到表达载体上作为 转化时的选择标记，如 Inv计rogen公司推出的 Gateway? Vector
14、 Conversion System with One Shot? ccdB SurvivaTM Competent Cells,就是在Gateway理的基础上，在中间载体两个重 组位点序列间添加ccdBS因。ccdB8因的表达产物能抑制普通E.coli生长，在克隆时没有 切开或者自身环化的载体在转化后不能生长。ccdB勺选择作用加上抗生素筛选，转化产物重组率可以高达90%以上。需要特别注意的是在CcdB#在的条件下，表达载体只能被 转化到非大肠杆菌宿主菌或是促旋酶发生突变的大肠杆菌中 18 o由于TA系统对细胞的杀伤作用是通过自然选择产生的，较之抗生素的抗菌作用，具所产生的抗药性的突变率要小
15、得多。所以，通过对这些天然毒素作用方式的研究，可以 更好的理解靶标酶的结构及作用机理，这为设计新的抗多重耐药细菌的治疗性药物提供 了重要依据。参考文献1. Kamphuis, M.B., et al. Model for RNA binding and the catalytic site of the RNase Kid of the bacterial parD toxin-antitoxin system. J Mol Biol, 2006, 357(1): 115-26.2. Gerdes, D.P.Pa.K. Toxin antitoxin loci are highly abund
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