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1、、Primer Premier 5.0的使用技巧简介1 .功能“Premier要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计、限制性 内切酶位点分析和DNA基元（motif查找。“Premie通具有同源Tt分析功能，但并非 其特长，在此略过。止匕外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物，另 外还有序列 朗读”、DNA与蛋白序列的互换、语音提示键盘输入等等。有时需要根据一段氨基酸序列反推到 DNA来设计引物，由于大多数氨基酸（20 种常见结构氨基酸中的18种的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA序 列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的
2、混 和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密 码规则因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不 一样的。“Premie可以针又t模板DNA的来源以相应的遗传密码规则转换DNA和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochon drion、支原 体（Mycoplasma、植物线粒体（Plant Mitochondrion 原生动物线粒体（P rotozoan Mitochondrion 一般标准（Stan
3、dard 脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondr ion 和 酵母线粒体（Yeast Mitochondriono2 .使用步骤及技巧“ Premie软件启动界面如下：其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述。限制性酶切点分析及基元 查找功能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制Tt内切酶或基元（如-10序歹L- 35序列等，按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编 辑或者添加新限制性内切酶或基元。进行引物设计时，点击按钮，界面如下：进一步点击按钮，出现“search criteria8口;有多种参数可以调整。搜索目的 （Seach ForW三
4、种选项，PCR 弓 I物（PCR Primers测序弓 I物（Sequencing Primers杂交探针（Hy bridization Probes。搜索类型（Search Type可选择分别或同时查找上、下游引 物（Sense/An ti-sense Prime或Both,或者成对查找（Pairs,或者分别以适合上、下游引 物为主（Co mpatible with Sense/Anti-sense Primer 另外还可改变选择区域（Search Ranges引物长度（Primer Length,选择方式（Search Mode参数选择（Search Parameters 等等。使用者可根
5、据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然后按，随之出现的Search Progress8口中显示Search Completed时，再按，这 时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense下游引物（Antisense成对显示（Pairs。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating排列,满分为100, 即各指标基本都能达标（如下图。点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪 开或退出，显示“Peimer Premier主窗口，如图所示：该图分三部分，最上面是图示PCR模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的 一些性质，最下面是四种重要指标的分析，
6、包括发夹结构（Hairpin,二聚体（Dimer,错误 引发情况（F alse Priming及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer。当所分析 的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的窗口中就会 出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有，只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的 最佳退火温度，可参考应用。在需要对引物进行修饰编辑时，如在5端加入酶切位点，可点击，然后修改引物序 列。若要回到搜索结果中，则点击按钮。如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传 密码规则,
7、反推至DNA序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。总之，“Premier优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，而且容 易使用，是一个相当不错的软件。二、Oligo 6.22使用技巧简介1 .功能在专门的引物设计软件中，“Oligo!最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学 者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0的初始界面是两个图:Tm图和AG图;Oligo 6.22的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq图。“Oligo的功能比“Premie还要单一, 就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。2 .使用（以Oligo 6.22为例Oligo 6.2
8、2的启动界面如下：图中显示的三个指标分别为 Tm、AGffi Frq,其中Frq是6.22版本的新功能，为 邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则 可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade列方式不太方便，可从windows菜单改为tili方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如 Frq,这样界面的结构同于Oligo 5.0,只是显示更清楚了。经过Windows/Tili项后的显示如图：在设计时，可依据图上三种指标的信息选取 序列,如果觉得合适，可点击Tm图块上左下角的Upper按钮,选好上游引物，此时该按 钮变成，表示上游引物已
9、选取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower0 ?G值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的？G值在5端和中间值比较 高，而在3端相对低（如图:Tm值曲线以选取72c附近为佳,5到3的下降形状也有利于引物引发聚合反应。 Frq曲线为“Oli go 6新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选 取引物时,宜选用3端Fr q值相对较低的片段。当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。 首先检查引物二聚体尤其是3端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体 有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer。二
10、聚体形成的能值越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆性PCR,对引物 位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。 第二项检查是发夹结构（hairpin;与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说， 这两项结构的能值以不超过4.5为好。当然，在设计克隆目的的PCR引物时，引物两 端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种PC R需要通 过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。 第三项检查为GC含量，以45-55%为宜。有一些模板本身的 GC含量偏低或偏高，导 致引物的GC含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使
11、上下游引物的 GC含量 以及Tm值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果 PCR的模板不是基因组DNA, 而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming s让e的检测。这项检查可以看 出引物在非目的位点引发PCR反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比 较高，就可能出假阳性的PCR结果。一般在错配引发效率以不超过 100为好,但对于 特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如 在正确位点的引发效率为450以上,而在错误位点的引发效率为130,那么这对引物 也是可以接受的。当我们结束以上四项检测，按Alt+P键弹出PCR窗口，其中总结性地显示该引物 的位置、产物大小、Tm值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单 的评价。由于“Oligo软件的引物自动搜索功能与 “Primer Premier 5勺相类似，并且 似乎并不比后者更好用，在此不再赘述。其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机 按照人的要求去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。