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1、二次谐 波的应用二次谐波成像是近年发展起来的一种 三维光学成像技术，具有非线性光学成像 所特有的高空间分辨率和高成像深度，可 避免双光子荧光成像中的荧光漂白效应。此外二次谐波信号对组织的结构对称 性变化高度敏感，因此二次谐波成像对于 某些疾病的早期诊断或术后治疗监测具 有很好的生物医学应用前景.二次谐波 英文名称： second harmoniccomponent定义：将非正弦周期信号按傅里叶级数展 开，频率为原信号频率两倍的正弦分量。SHG的一个必要条件是需要没要反演对 称的介质其次是必须满足相位匹配，传播 中的倍频光波和不断昌盛的倍频极化波 保持了相位的一致性.谐波产生的根本原因是由于非线
2、性负载 所致。当电流流经负载时，与所加的电压 不呈线性关系，就形成非正弦电流，从而 产生谐波。S HG实验装置S HG实验装置按二次谐波信号收集方式可分为前向和后向，图2为前向和后向二次谐波产生的实 验装置示意图.以图2 （a）为例：由激 光器产生 的角频率为 的入射基频光， 经过物镜聚焦到样品上，产生频率为2的二次谐波，由另一个高数值孔径的物镜收集，滤光片（一般为窄带滤光片）滤 掉激发光和可能产生的荧光和其他背景 光，再用探测器件（如PMT）和计算 机系统进行信号的采集、存储、分析和显示.要实现二次谐波 微成像需要对 以下因素进行 最优化考虑：超短脉冲激 光、高数值孑L径的显微物镜、高灵敏度
3、的非解扫面探测器、准相位匹配和具 有高二阶非线性的样品J . 激光器：掺T i蓝宝石飞秒激光器因具有高重 复频率（80MH z ）和高峰值功率，单脉冲能量低且町在整个近红外区（7 0 010 0 0 n m）内连续调 谐，所以是二次谐波显微成像的理想光源.激 光的重复频率对S HG也有影响，如果提高激发光的重 复频率，激发光的平均功 率可相应提高，二次谐波信号也得到增 强.物镜：一般情况下，二次谐波主要非 轴向发射，即信号收集时必须有一个足够 大的数值孑L径来有效接收整个二次谐波信号.滤光片：为保证所收集的信号为二次谐波信号，必须使用滤光 片.一般采用一长波滤光片和窄带滤光片(带宽1 0n m
4、)组合以过滤任何干扰信号.信号收集系统：为尽晕减少二次谐波信号在系 统中的损失，提高系统 的探测灵敏度，最好采用非解扫(n on . de scanned)的信号.信号 收集系统中的主要部件是PMT探测器.首先，为收集整个二次谐波信号，需要探测器的接收面足够宽.其次，对 于由可调谐T i :蓝宝石飞秒激光器，要 接收的二次 谐波信号处于3 5 0 -5 0 0 n m波段，故可采用双碱阴极光电倍增管.由于激发光波长离探测器的响 应区 很远，故可有效探N -次谐波信 号. 除了使用不同的滤光片外，二次谐波显微成像 和双光子激发荧光显微成 像在系统结构上是完全兼容的.已有人成功地将激光扫描共聚焦显
5、微镜改造 成双光子系统 9 ，同样，也可以方便 的用改造后的系统进行两者的复合成像二次谐波显微成像技术的发展及其在生 物医学中的应用.细胞膜电压的测量对理解细胞信号传 递过程有重要作用.使用合适的膜染剂进 行标记，通过对染剂分子的二次谐波显微 成像，信号强度变化便能反映膜电压的大 小.近年来，二次谐波显微成像的一个主要 领域，就是发展具有高时空分辨率及高灵 敏度的活细胞中横跨膜电压的光学测量 方法.SHG成像用于膜电压测量细胞膜电压的测量对理解细胞信号传递过程有 重要作用.使用合适的膜染剂进行标记， 通过对染剂分子的二次谐波显微成像， 信号强度变化便能反映膜电压的大小.近年来，二次谐波显微成像
6、的一个主要领域，就是发展具有高时空分辨率及 高灵敏 度的活细胞中横跨膜电压的光 学测量方法.1993 年，O Bou e v i t c h等人. 证明，所加电场可 强烈地调制SHG强度.1 9 9 9年， P J Campagno! a 等人 则 证明了SHG信号随膜电压变化.实验结 果表明，激发波长为8 5 0 nm时，S H G对膜电压的灵敏度为18/100 mV,而TPE F只有10/10 0 mV J .2004 年， And r e w等人进一步研究了苯乙烯基染剂产生的二次谐波信号对膜电压的敏感性.实验表明，使用8 5 0910n m的激发波长，膜染剂d i -4 . AN EPP
7、S和di4. ANEPMPOH 使S H G对膜电压的敏感度高达2 0/ 10 0 mV,且由于共振增强，使用9 5 0 9 7 0nm的激发波长时，敏感度达到4 0 / 1 0 0mV .这些研究结果 进一步巩固了 S H G在活细胞中膜电压的功能成像中的重要性. 最近，Cornell大学的科学家，通过 使用一种低毒性的有机染剂D H P ES B P ,对海参神经细胞进行二次谐波微成像（如图5）,并成功实现了脑组 织 巾的电脉冲成像 ，这对于解渎大脑工 作过程，解释大脑退化疾病如A 1 z he i m e r ? s症等，具有巨大度、高空 间分辨率和对生物的低杀伤性特点，为活 体测量提供
8、了一种新方法，有望成为组织 形态学和生理学研究的个强大工具.目 的，SHG在神经科 学、药理学及疾病 早期断方面的应用研究已取得一些进展.但二次谐波成像还是一 .不很成熟 的技 术，随着研究的逐步深入，对它的 应用仍然有待进一步的开发.随着微光 纤技术的发展，二次谐波成像技术还可与光纤光学结合进行人体内窥镜检查， 实现活体生物体内深处的组织在分子水 平的成像.随着信号检测技术和计算机技术等的发展，还可运 用二次谐波成像 实时观察生物细胞活动.由于二次谐波显微应用于肌纤维长度的精确度已达到2 0 n m，活体未标记心脏和肌 肉组织的纳米药理学研究也将发挥很大的作用.本实验室正着手研究将次谐波成像
9、、共聚焦显微成像以及双光子激发荧 光成像结合，根据视网膜的分层结 构和特点，采用 不 方法成像，进而揭 示视网膜的正常生理结构及病变部位，为视网膜疾病的早期诊断提供一种新型 的具有三维高空间分辨牢的手段相位匹配及实现方法实验证明，只有具有特定偏振方向的线偏振光，以某一特定角度入射晶体时, 才能获得良好的倍频效果，而以其他角度入射时，则倍频效果很差，甚至完全 不出倍频光。根据倍频转换效率的定义p23 刀 P ,(15)经理论推导可得2一 - 2 一 2?d?L ?EWo(16)sin2(L? k/2)2(L? k/2)2“与Lk/2关系曲线见图1。图中可看出，要获得最大的转换效率，就要使 Lk/
10、2=0, L是倍频晶体的通光长度，不等于 0,故应k=0,即-2-0 兀 2 Lk/21倍频效率42k 2ki k2(n n2 ) 01 )（17）就是使（18）n。和n2。分别为晶体对基频光和倍频光的折射率。 也就是只有当基频光和倍频光 的折射率相等时，才能产生好的倍频效果，式（18）是提高倍频效率的必要条 件，称作相位匹配条件。由于V3=c/n。，V23 = c/n2。，V3和V2a分别是基频光和倍频光在晶体中的传播速度。满足（18）式，就是要求基频光和倍频光在晶体中的传播速度相等。从这里我们可以清楚地看出，所谓相位匹配条件的物理实质就是使基频光在晶 体中沿途各点激发的倍频光传播到出射面时
11、，都具有相同的相位，这样可相互 干涉增强，从而达到好的倍频效果。实现相位匹配条件的方法：由于一般介质存在正常色散效果，即高频光的折射率大于低频光的折射率，如 n2。一n大约为102数量级。kw0。但对于各向 同性晶体，由于存在双折射，我们则可利用不同偏振光间的折射率关系，寻找 到相位匹配条件，实现 k = 0。此方法常用于负单轴晶体，下面以负单轴晶体为角，sin2图2负单轴9 m可从下式中计算得出例说明。图2中画出了晶体中基频光和 倍频光的两种不同偏振态折射率面问 的关系。图中实线球面为基频光折射率 面，虚线球面为倍频光折射率面，球面 为o光折射率面，椭球面为e光折射 率面，z轴为光轴。折射率
12、面的定义：从球心引出的每 一条矢径到达面上某点的长度，表示晶 体以此矢径为波法线方向的光波的折 射率大小。实现相位匹配条件的方法之 一是寻找实面和虚面交点位置，从而得 到通过此交点的矢径与光轴的夹角。图 中看到，基频光中o光的折射率可以 和倍频光中e光的折射率相等，所以当 光波沿着与光轴成8 m角方向传播时， 即可实现相位匹配，9 m叫做相位匹配(n。)2 (nO)2(n2 ) 2 (n2 ) 2 ,22式中no,n。，3都可以查表得到，表1列出几种常用的数值。表1相位匹配角晶体入/mnone6 m锯酸锂87o碘酸锂29o30KD*P30o57注意，相位匹配角是指在晶体中基频光相对于晶体光轴
13、z方向的夹角，而不是与入射面法线的夹角。为了减少反射损失和便于调节，实验中一般总希望让 基频光正入射晶体表面。所以加工倍频晶体时，须按一定方向切割晶体，以使 晶体法线方向和光轴方向成8 m,见图3。基频一一晶面I图3非线性以上所述，是入射光以一定 角度入射晶体，通过晶体的双 折射，由折射率的变化来补偿 正常色散而实现相位匹配的， 这称为角度相位匹配。角度相 位匹配又可分为两类。第一类 是入射同一种线偏振光，负单轴晶体将两个e光光子转变为一个倍频的o光光子。第二类是入射光中同时含有。光和e光两种线偏振光，负单轴晶体将两个不同的光子变为倍频的e光光子，正单轴晶体变为一个倍频的 o光光子。见表2表2
14、单轴晶体的相位匹配条件晶体种类第一类相位匹配第二类相位匹配偏振性质相位匹配条 件偏振性质相位匹配条件正单轴e e one ( m ) n oo e o工none( m) n22负单轴o o en on e ( m )e o e1 r/、，2 / 、一 ne ( m) no ne ( m) 2本实验用的是负单轴花酸锂晶体第一类相位匹配相位匹配的方法除了前述的角度匹配外，还 有温度匹配，这里不作细述。在影响倍频效率的诸因素中，除前述的比较重要的三方面外，还需考虑到晶体的有效长度和模式状况。图4为晶体中基频光和倍频光振幅随距离的变化。如果晶体过长，例LL时，会造成倍频效率饱和；晶体过短。例Lls,则
15、转换效率比较低。Ls的大小基本给出了倍频技术中 应该使用的晶体长度。模式的不同也影响转换效率，如高阶横模，方向性差， 偏离光传播方向的光会偏离相位匹配角。所以在不降低入射光功率的情况下， 以选用基横模或低阶横模为宜。V V V V V V值。基领光C功率为i 5. 倍频光的脉冲宽度和线宽通过对倍频光脉冲宽 度t和相对线宽v的观测， 还可看到两种线宽都比基 频光变窄的现象。这是由于 倍频光强与入射基频光强 的平方成比例的缘故。图5 中，假设在t = b时。基频 和倍频光具有相同的极大,力水冲宽度t1=t111,而在相同的时间问隔内，倍频光的功率却为峰值的 1/4,倍频光的半值宽度t2 12V t
16、i-ti, 即t2ti,脉冲宽度变窄。同样道理可得到倍频后的谱线宽度也会变窄。1064532:I 类匹配为 theta=90 phi=25CII 类为 theta= phi=9025 CLBO匹配分两种，一种为非临界相位匹配，一种为临界相位匹配即角度匹配.后一 种都是在常温下使用的，也可以根据不同的工作温度进行角度的调整。二次谐 波的应用二次谐波成像是近年发展起来的一种 三维光学成像技术，具有非线性光学成像 所特有的高空间分辨率和高成像深度，可 避免双光子荧光成像中的荧光漂白效应。此外二次谐波信号对组织的结构对称 性变化高度敏感，因此二次谐波成像对于某些疾病的早期诊断或术后治疗监测具 有很好的
17、生物医学应用前景.二次谐波 英文名称： second harmonic component定义：将非正弦周期信号按傅里叶级数展 开，频率为原信号频率两倍的正弦分量。SHG的一个必要条件是需要没要反演对 称的介质其次是必须满足相位匹配，传播 中的倍频光波和不断昌盛的倍频极化波 保持了相位的一致性.谐波产生的根本原因是由于非线性负载 所致。当电流流经负载时，与所加的电压 不呈线性关系，就形成非正弦电流，从而 产生谐波。S HG实验装置S HG实验装置按二次谐波信号收集方式可分为前向和后向，图2为前向和后向二次谐波产生的实 验装置示意图.以图2 (a)为例：由激 光器产生的角频率为的入射基频光， 经
18、过物镜聚焦到样品上，产生频率为2的二次谐波，由另一个高数值孔径的物镜收集，滤光片(一般为窄带滤光片)滤掉激发光和可能产生的荧光和其他背景 光，再用探测器件（如PMT）和计算 机系统进行信号的采集、存储、分析和显示.要实现二次谐波 微成像需要对以下因素进行最优化考虑：超短脉冲激 光、高数值孑L径的显微物镜、高灵敏度的非解扫面探测器、准相位匹配和具 有高二阶非线性的样品J . 激光器：掺T i蓝宝石飞秒激光器因具有高重 复频率（80MHz）和高峰值功率，单脉冲能量低且町在整个近红外区（7 0 0-10 0 0 n m）内连续调 谐，所以是二次谐波显微成像的理想光源.激 光的重复频率对SHG也有影响
19、，如果提 高激发光的重复频率，激发光的平均功 率可相应提高，二次谐波信号也得到增 强.物镜：一般情况下，二次谐波主要非 轴向发射，即信号收集时必须有一个足够 大的数值孑L径来有效接收整个二次谐波信号.滤光片：为保证所收集的信号为二次谐波信号，必须使用滤光 片.一般采用一长波滤光片和窄 带滤光片(带宽1 0 n m)组合以过滤任何干 扰信号.信号收集系统：为尽晕减少二次谐波信号在系 统中的损失，提高系统 的探测灵敏度，最好采用非解扫(n on. de scanned) 的信号.信号 收集系统中的主要部件是PMT探测器.首先，为收集整个二次谐波信号，需要探测器的接收面足够宽.其次，对 于由可调谐T
20、 i :蓝宝石飞秒激光器，要 接收的二次谐波信号处于3 5 0 -50 0 n m波段，故可米用双碱阴极光电倍增管.由于激发光波长离探测器的响 应区 很远，故可有效探N-次谐波信 号. 除了使用不同的滤光片外，二次谐 波显微成像和双光子激发荧光显微成像在系统结构上是完全兼容的.已有人成功地将激光扫描共聚焦显微镜改造 成双光子系统 9 ，同样，也可以方便 的用改造后的系统进行两者的复合成像二次谐波显微成像技术的发展及其在生 物医学中的应用.细胞膜电压的测量对理解细胞信号传 递过程有重要作用.使用合适的膜染剂进 行标记，通过对染剂分子的二次谐波显微 成像，信号强度变化便能反映膜电压的大 小.近年来
21、，二次谐波显微成像的一个主要 领域，就是发展具有高时空分辨率及高灵 敏度的活细胞中横跨膜电压的光学测量 方法.SHG成像用于膜电压测量细胞膜电压的测量对理解细胞信号传递过程有 重要作用.使用合适的膜染剂进行标记， 通过对染剂分子的二次谐波显微成像， 信号强度变化便能反映膜电压的大 小.近年来，二次谐波显微成像的一个主要领域，就是发展具有高时空分辨率及 高灵敏 度的活细胞中横跨膜电压的光 学测量方法.1993 年，O Bou e v i t c h等人.证明，所加电场可强烈地 调制SHG强度.1 9 9 9年， P J Campagno! a 等人 则 证明了SHG信号随膜电压变化.实验结果表明
22、，激发波长为8 5 0 nm时，S HG对膜电压的灵敏度为18/100 mV,而 TPE F 只有 10/10 0 mV J .2004 年， And r e w等人进一步研究了苯乙烯基染剂产生的二次谐波信号对膜电压的敏感性.实验表明，使用8 5 0910n m的激发波长，膜染剂d i -4 . AN EPPS和di4. ANEPMPOH 使SHG对膜电压的敏感度高达2 0/ 1 0 0 mV,且由于共振增强，使用9 5 0 9 7 0 nm的激发波长时，敏 感度达到4 0 / 1 0 0 mV .这些研 究结果 进一步巩固了 SHG在活细胞 中膜电压的功能成像中的重要性.最近，Cornell
23、大学的科学家，通过 使用一种低毒性的有机染剂DHP ES B P ,对海参神经细胞进行二次谐波微成像（如图5 ）,并成功实现了脑组 织 巾的电脉冲成像一，这对于解渎大脑工作过程，解释大脑退化疾病如A 1 z he i m e r s症等，具有巨大度、高空间分辨率和对生物的低杀伤性特点，为活 体测量提供了一种新方法，有望成为组织 形态学和生理学研究的个强大工具.目 的，SHG在神经科 学、药理学及疾病 早期 断方面的应用研究已取得一些进展.但二次谐波成像还是一 .不很成熟 的技 术，随着研究的逐步深入，对它的 应用仍然有待进一步的开发.随着微光 纤技术的发展，二次谐波成像技术还可与光纤光学结合进行人体内窥镜检查， 实现活体生物体内深处的组织在分子水 平的成像.随着信号检测技术和计算机技术等的发展，还可运 用二次谐波成像 实时观察生物细胞活动.由于二次谐波显微应用于肌纤维长度的精确度已达到 2 0 n m，活体未标记心脏和肌 肉组织的纳米药理学研究也将发挥很大的作用.本实验室正着手研究将次谐波成像、共聚焦显微成像以及双光子激 发荧光成像结合，根据视网膜的分层结 构和特点，采用 不 方法成像，进而揭 示视网膜的正常生理结构及病变部位，为视网膜疾病的早期诊断提供一种新型 的具有三维高空间分辨牢的手段