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1、1,蛋白质定向进化技术的发展和应用构建新蛋白质(酶)的一种途径,2,生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中，并维持其独立性和生命的延续性，都是因为生物体内的一系列酶在发挥着作用。,3,酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应得以按照预定的方向有序、精确而顺利地进行，几乎所有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关，可以这样说，没有酶的存在，就没有生物体的一切生命活动。,4,酶的工业应用: 利用酶作为催化剂进行生物催化与生物转化，已成为生产精细化学品、手性药物、食品添加剂等的重要工具,获得了广泛应用。,5,天然酶的局限: 随着酶催化应用范围的不断扩大和研究的逐步深入，研究者已经越来越发现，现有的
2、天然酶的催化特性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求。,6,主要原因：1 天然酶的稳定性差、对某些底物的催 化活性低，以及缺乏有商业价值的 催化功能及其他性质2 越来越多的情况需要一些酶催化很 多在自然界中并不存在的各种底物 来完成特定的反应过程,7,根源: 天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。,8,天然酶的进化过程: 在自然进化过程中，进化保证了酶对环境任何改变的适应能力，但是自然进化既没有特定的方向，也没有特定的目标，它是在整个生物的繁殖和生存过程中自发进行.,9,酶的进化主要不是表现为某个酶分子的活力和稳定性的不断提高，而是在于生物整体的适应能力、调控能力的增强，因此，通常只要求
3、酶在生物体内对特定的生物学功能有专一性。,10,应用过程对酶的要求 在酶催化过程的研究和应用过程中，人们总是期望酶的活力和稳定性越高越好，并具备良好的催化性能：能在非水溶剂、极端温度和pH等特殊条件下催化反应，尤其重要的是能接受自然界中不存在的各种底物。,11,正是由于天然酶的性质与实际应用过程中人们对酶的期望之间的巨大差距，使对天然酶在分子水平上进行改造显得十分重要和迫切。,12,从目前的情况来看，具有新功能和特性的酶可以通过从大量未知的自然种系中寻找以及对现有的天然酶进行改造，其中对于在自然进化过程中没有经过特性和功能选择的酶而言，对现有的天然酶进行改造比大量筛选可能更加合适。,13,对酶
4、进行改造的理论基础: 无数的研究工作已经表明，酶分子内某些氨基酸残基的微小改变可使酶的催化能力和立体选择性产生很大的改善。,14,遗憾的是，由于技术的限制，酶分子中氨基酸残基与它的空间结构以及结构功能之间相互关系等信息严重匮乏，加上这些关系又非常复杂，迄今为止，人们对它们的理解和认识仍然非常肤浅,15,如何利用相对简单的方法以达到对天然酶的改造或构建新的非天然酶就显得非常有研究意义和应用前景。,16,解决办法:蛋白质定向进化 20世纪80年代末，在PCR技术出现的初期，就有人着手利用Error-prone PCR技术改造蛋白质。1994年，美国科学家Stemmer 开创了可以在分子水平上实现家
5、族基金内部序列重组的新技术DNA Shuffling，可以在一个基因及其PCR诱变产物，或一组家族基因的基础上创造新基因。,17,酶分子的定向进化技术 人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。,18,定向进化技术的作用 使发生在自然界中漫长的进化过程能在实验室中得以模拟，使人类可以按照自己的意愿和需要改造酶分子，甚至设计出自然界中原来并不存在的全新酶分子(全新蛋白质)。,19,与自然进化相比，酶分子的
6、定向进化过程完全是在人为控制下进行的，使酶分子朝向人们期望的特定目标进化。,20,大量的研究已经表明：在目前对酶分子认识还不成熟的情况下，通过DNA水平上的适当修饰来改变酶的氨基酸顺序，进而改变酶的性能，是可能在重组生物中产生新的酶类，并获得比天然酶活力更高、稳定性和催化性能更好的进化酶，以满足研究和应用的需要。,21,定向进化技术( directed evolution)的原理,Susanne Brakmann and Kai Johnsson (eds)Directed Molecular Evolution of ProteinsWiley-VCH,2002, ISBN 3-527-30
7、423-1,22,定向进化过程的原理,23,分子生物学文库的分类与构建方法,24,定向进化技术的发展,定点突变（site-specific mutagenesis或site-directed mutagenesis）易错PCR技术(error prone PCR)DNA改组(DNA shuflling)：由美国Stemmer 于1994 年首次提出 一项体外重组技术随机引导重组(RPR) 1998 年,Arnold 提出了一种有效的新方法交错延伸技术(StEP)：由Zhao 等 提出, 是一种简化的DNA shuffling 技术 过渡模板随机嵌合生长(RACHITT)：与DNA shuffl
8、ing 概念上明显不同的、改进的基因家族重组技术.,25,定点突变,定点突变（site-specific mutagenesis或site-directed mutagenesis）是指在目的DNA片断（例如：一个基因）的指定位点上引入特定的碱基对变化的技术。最早的通用性定点突变技术是由M. Smith的研究小组于1982年发明的，这种基于M13噬菌体载体的定点突变技术可以在任意一段DNA片断的特点位点上引入点突变。这一技术在其发明后的一段时间曾被世界各国的研究者广泛使用。Smith后来还因为此项研究与PCR的发明者Mullis共享了1993年的诺贝尔化学奖。,26,基于M13载体的寡核苷酸介
9、导定点突变,27,基于M13载体的寡核苷酸介导定点突变,理论上，如果含突变的DNA链和正常的DNA链复制速率相同，应该有50%的克隆带突变基因。但是，由于许多技术上的原因，实际上一般只有1%到5%的克隆带突变基因。显然，这样的效率还不尽人意。此后，研究者又设计出很多方法以提高定点突变的频率，其中比较常用的Kunkel提出的一种配合该技术的诱变体产量富集法。,28,Kunkel的诱变体产量富集法,Kunkel提出的这种方法用具dut和ung基因缺陷的大肠杆菌制备M13载体。dut基因编码催化dUTP 分解的dUTPase，该基因缺陷会使细胞中dUTP含量升高，导致复制时少量dUTP代替dTTP掺
10、入DNA。ung 基因编码尿嘧啶DNA糖基化酶，该基因缺失后，不能除去掺入DNA的dUTP。因此，利用dut ung 菌株制备的M13载体中，大约1%的T被U取代。以这样制备的M13(+)链为模板进行寡核苷酸介导的定点突变，然后将得到的双链DNA转化到dut+ ung+菌株中，最初的含UU的模板会被降解，而突变链则因不含U被复制。这样，带有定点突变基因的噬菌体比例可显著提高。,29,Kunkel的诱变体产量富集法,30,以双链DNA为模板的定点突变,31,定点突变的应用实例 T4溶菌酶及其几个突变种的特性,注：Tm为蛋白质的总体结构50%发生变性的温度，用以表征蛋白质的热稳定性。,32,易错P
11、CR（error-prone PCR，简称EP-PCR）,利用PCR过程中出现的碱基错配对特定基因进行随机诱变的技术称为易错PCR（error-prone PCR，简称EP-PCR）。为了降低PCR中DNA复制的精确度，最常用的方法是在Taq DNA聚合酶催化的PCR反应体系中加入一定量的Mn2+（替代天然的辅助因子Mg2+），并同时使反应体系中各种dNTP的比例失衡（通常是将其中的一种dNTP降至5%10%）。这样，由于Taq DNA聚合酶缺乏校对活性，其错配率会大大增加，通常可以达到每千碱基对1个突变左右。另外，还可以加入dITP等三磷酸脱氧核苷类似物来控制错配水平，采用这种方法可以将错配
12、率提高到最高达每5个碱基对1个突变。当然，错配率并不是越高越好，一般认为，理想的突变频率为每个基因1.55个点突变。,33,error-pronePCR,34,DNA重排的原理及步骤,35,随机引导重组(RPR),体外随机引导重组是以单链DNA为模板，配合一套随机引物，产生互补于模板不同位置的短DNA 片段库(由于碱基错配，这些短DNA 片段也含有少量的点突变)，然后进行类似于DNA shuffling的全长基因装配反应，获得多样性文库。与DNA shuffling相比，RPR具有以下优点：a用单链DNA为模板对模板量要求少，大大降低了亲本组分， 便利筛选b克服了DNA shuffling中片
13、段重新组装前必须彻底去除DNase I的缺点c片段组装体系与片段合成体系缓冲系统可兼容，组装前无需纯化操作d随机引发DNA合成不受模板DNA长度的限制，便利了小肽的改造,36,随机引导重组(RPR),37,交叉延伸程序（Staggered extension process，StEP）,交叉延伸程序（Staggered extension process，StEP）是一种简化并改进的DNA重排技术。它是由France Arnold研究小组在1997年提出的。在一个PCR反应体系中以两个以上相关的DNA片段为模板进行PCR反应。引物先在一个模板链上延伸，随之进行多轮变性、短暂复性（延伸）过程，在
14、每一轮PCR循环中，那些部分延伸的片段可以随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸，由于模板转换而实现不同模板间的重组，这样重复进行直到获得全长基因片段，重组的程度可以通过调整时间和温度来控制。此方法省去了将DNA酶切成片段这一步，因而简化了DNA重排方法。,38,交叉延伸程序,39,过渡模板随机嵌合生长(random chimeragenesis on transient templates，RACHITT),过渡模板随机嵌合生长技术是与DNA shuffling概念上明显不同的、改进的基因家族重组技术它不包括热循环、链转移或交错延伸反应，而是将随机切割的基因片段杂交到一个临时DNA模板上进行
15、排序、修剪、空隙填补和连接。其中的悬垂切割步骤使短片段(比DNase消化片段还短)得以重组，明显提高了重组频率；如果在片段重组前后采用错误倾向PCR还可引入额外点突变。,40,RACHITT,41,RACHITT,Coco等报道此法改造二苯并噻吩单加氧酶，产生的嵌合文库平均每个基因含14个交叉，重组水平比DNA shuffling类方法(14个交叉)高出几倍；并且可在短至5 bp的序列同一区内产生交叉。这种高频率、高密度的交叉水平是DNAshuffling所难以达到的。,42,分子定向进化技术经典实例头孢菌素酶基因的单基因重排和家族基因重排,Moxalactam,羟羧氧酰胺头孢菌素,43,头孢
16、菌素酶基因的单基因重排和家族基因重排,首先从四种不同的细菌中分别获得长度为1.6kb的头孢菌素酶基因。它们的DNA同源性很低，从58%到82%不等。然后每个基因分别重排，从各自的文库中选出50000个克隆子移入含羟羧氧酰胺头孢菌素的平板。从平板上筛选得到的最好的突变子，它对羟羧氧酰胺头孢菌素的抗性相对于亲本来说大约增加了8倍。 作为比较，对四个基因进行家族基因重排来构造头孢菌素酶基因的重组文库。同样选出50000个克隆子移入含羟羧氧酰胺头孢菌素的平板，从中筛选出的最好的克隆子，与抗性较强的亲本相比，其抗性增加了270倍（从0.38g/ml到200g/ml）；与抗性较弱的亲本相比，其抗性增加了540倍（从0.75g/ml到200g/ml）。由此可以看出，家族基因重排的效果要比单基因重排好得多。 对家族基因重排中得到的最好克隆子进行进一步研究表明它含有来源于4个不同亲本中3个亲本的8个片段，7个交叉的地方都发生在序列同源的区域，并且这个最好的克隆子含有高达33个的点突变。,