分子生物学作业.docx

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1、分子生物学作业一、名词解释1 .断裂基因真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区相互间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸 组成的完整蛋白质，这些基因成为断裂基因。2 .单核甘酸多态性单核甘酸多态性是由基因组 DNA上的单个碱基的变异引起的 DNA 序列多态性。是人群中个体差异最具代表性的DNA多态性，相当一部分还直接或间接与个体的表型差异、对疾病的易感性或抵抗 能力、对药物的反应性等相关。单核甘酸多态性被认为是一种能 稳定遗传的早期突变。一、 简答题1 .简述真核生物基因组的结构与功能特点。真核生物基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内，除配子细胞外

2、，体细胞内基因组是双份的（即双倍体），有两份同源的基因组。真核生物的基因转录产物为单顺反子。即一个结构基因经过转录生成一个mRNA子，再翻译生成一条多肽链。真核生物基因组存在重复序列，重复次数可达百万次以上。真核生物基因组中不编码的区域多于编码的区域。真核生物的大部分基因都含有内含子，因此，基因是不连续的（断裂基因）真核生物基因组远远大于原核生物的基因组，具有多复制起始 点，而每个复制子的长度较小。2 .试述双向凝胶电泳技术的基本原理。双向凝胶电泳技术是指第一向的固相 pH梯度等电聚焦电泳与 第二向SDS-PAG祖成的分离系统，也称双向聚丙烯酰胺凝胶电泳， 简称2-DE。等电聚焦电泳是基于蛋白

3、质等电点（pl）的差异进行 分离，SDS-PAG剧是根据蛋白质分子量（MW的不同进行分离。其中等电聚焦指：在电场中电泳基质形成一个从正极到负极 不断增大的PH梯度，由于蛋白质为两性电解质，带负电荷的蛋白 质分子向正极移动，待正电荷的蛋白质分子向负极移动，当蛋白 质分子运动到各自的PI处时，所带净电荷变为零，于是停止迁移 而留在该位置上，这种不同的蛋白质分别聚焦在各自的PI处，形成一条狭窄稳定的区带而彼此分开的现象就称为等电点聚焦。SDS-PAG罡在PAG系统中加入SDSffi还原剂后所组成的电泳 系统。SDSM一种阴离子去垢剂，疏水端能插入蛋白质分子内，破 坏蛋白质分子内的氢键及疏水作用，改变

4、蛋白质分子的三级和四 级结构；还原剂则断裂蛋白质分子内的二硫键，使蛋白质分子去 折叠，结构变得舒展。蛋白质分子与 SDS充分结合后，形成带负 电荷的蛋白质-SDS复合物，所带负电荷大大超过蛋白质分子原有 的电荷量，消除了不同分子间原有电荷的差异。蛋白质 -SDS复合 物在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中的迁移率不再与电荷相关，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，及蛋白质的分子量大小。3 .分子克隆技术包括哪些基本步骤？包括：目的基因的获取：载体的选择；目的基因与载体连接： 重组DNAI入受体细胞；重组体的筛选。4 .目的基因和载体连接主要有哪些方法？粘性末端DN砌子的连接 平末端连接法通过同聚尾连接5 .简

5、述分子克隆中常用的工具酶及其作用。限制性核酸内切酶：能根据需要在特定的位点上精确切割双链DNA分子。DNA!合酶：1. DNA聚合酶I和Klenow片段DNA聚合酶I 5 -3 DN谦合酶活性3 5核酸外切酶活性5 3核酸外切酶。Klenow 片段作用活性补齐双链 DNA勺3末端，同时可使3末端DN雨记上 同位素。cDNAS隆中，合成cDNA第二链。DNAff列分析。2.Taq DNA 聚合酶 Taq酶具有5 -3聚合酶活性和依赖于聚合作用的 5 -3 外切酶活性。3.逆转录酶反转录作用核酸酶H的水解作用依赖D N A 的D N A聚合酶作用。4 .末端脱氧核甘酰转移酶在载体或目的基因3末端加

6、上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接。用于DNA 3末端的同位素探针标记。DNA11接酶：能催化两个互补粘性末端双链 DN心子的5磷酸基团与3羟基形成磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平末端的DNA连接起来。碱性磷酸酶：能除去DNAt段上的5磷酸以防自身连接；在使用 T4多核甘酸激酶和32P同位素标记前，从RNAlg DNAk出去5端的 磷酸。T4多核甘酸激酶：既能连接粘性末端，又能连接平末端。核酸酶S1:可除去粘性末端以产生平末端，除去 cDNAa成时形成 的发夹结构，分析RNA勺茎环2构和DNA-RN册子的杂交情况。6 .举例说明载体应具备的基本要素。能自我复制并具较高的

7、拷贝数分子量一般10Kb带有遗传筛选标记有适当的限制酶酶切位点，便于外源 DNA勺插入和筛选如pBR322质粒克隆载体，它是由一系列大肠杆菌质粒 DNAS过DNA 重组技术构建而成的双链克隆载体，长为4.36Kb。它含有一个能保证高拷贝自我复制的复制起始点（Ori）,并装有四环素抗性（Tetr） 基因和氨节青霉素抗性（Amp。基因供菌落筛选。在这两个抗性基因 中分别含有BamH I和Pst I等限制酶的单一酶切位点，用于插入外 源DNAt段。如有外源基因的插入，会导致这些标志性基因的失活。7 .简述双抗生素筛选和蓝白斑筛选的原理。双抗生素筛选：某些质粒载体如pBR322质粒中有Ampr和Tet

8、r抗性 基因，在这两个基因中装有几个常用的 MCS如将外源DNAt段插入BamH识别序列时，则此质粒由 Tetr变为对四环素敏感（Tets ）。 这种重组子导入宿主菌后，宿主菌在含四环素琼脂糖平皿上不能生长 而在含氨节青霉素的平皿上能够生长。在含四环素和氨节青霉素的平 皿上都能够生长的细菌只含有空载体，此筛选方法称为双抗生素筛选 法蓝白班筛选：某些质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子的lacZ基因，该基因含一段编码-半乳糖甘酶氨基末端145个氨基酸-肽的DNA片 段，IPTG可诱导此片段合成，此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型 -半乳糖普酶实现基因内-互补，形成完整的-半乳糖甘酶，催化指示 剂底物X-

9、gal形成蓝色产物，结果重组克隆呈蓝色菌落。当外源基 因插入lacZ基因中MCS lac -肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无 -半乳糖甘酶活性，结果重组克隆呈白色菌落，这是常用的蓝白斑筛 选法。8 .有哪些常用的探针标记物？常用的探针标记物有：光敏生物素、生物素化补骨脂素、 FITC和罗 丹明、地高辛、%32PdNTR 丫 32PdNTR 35S、3H Bio-ll-dUTP、 HR林口 ALB9 .如何进行探针的标记？缺口平移法、随机引物法、末端标记法、聚合酶链式反应。10 影响核酸分子杂交的因素有那些？如何进行杂交条件的优化？ 影响因素：1）核酸分子的浓度和长度：核酸浓度越大，复性速度越快

10、。探针长度应控制在50-300个碱基对为好2）温度：温度过高不利于复性，而温度过低，少数碱基配对形成的 局部双链不易解离，适宜的温度是较 Tm值低25度。3）离子强度：在低离子强度下，核酸杂交非常缓慢，随着离子强度 增加，杂交反应率增加。高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，所 以进行序列不完全同源的核酸分子杂交时必须维持杂交反应液中盐 浓度和洗膜液中的盐浓度。4）杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的 Tm直，它有以下优 点：在低温下探针更稳定；能更好地保留非共价结合的核酸。5）核酸分子的复杂性：是指存在于反应体系中的不同顺序的总长度。两个不同基因组DNA变性后的相对杂交速率取决于样品浓度绝

11、对一 致时的相对复杂性（即DNA中的碱基数）。6）非特异性杂交反应：在杂交前应对非特异性杂交反应位点进行封 闭，以减少其对探针的非特异性吸附作用。杂交条件的优化：1）探针的选择：检测单个碱基改变选用寡核甘酸探针；检测单链靶 序列选用与其互补的DN婵链探针或RN琳针；长的双链DN砥针特 异性较强，适宜检测复杂的靶核甘酸序列和病原体；100bp左右的探针适合原位杂交。2）探针的标记方法：在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、 显示灵敏的探针标记方法；在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长 的生物素探针技术和价廉的HRPS示系统等。3）探针的浓度：随探针浓度增加，杂交率也增加，在较窄的范围内， 随

12、探针浓度增加，敏感性增加。膜杂交中32P标记探针与非放射性标 记探针的用量分别为 5 10ng/ml和251000ng/ml ;原位杂交中， 一般各种标记探针，其用量均为 0.5 5.0 w g/ml。4）杂交最适温度：若反应温度低于 Tm 1015C,碱基顺序高度同 源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。一般情况下，在不含变性剂甲酰胺时，大多数杂交反应在 65c进行，当含50期酰胺时，在 42c进行。5）杂交反应时间：杂交时间短了，反应无法完成；长了引起非特异 结合增多。一般杂交20 h左右。6）洗膜温度：杂交后的最终洗膜温度一般应低于 Tmf直572c进行c 7）杂交液的优化：通常用于D

13、NA杂交的标准杂交液为5*SSC,1.0%casein, 0.1%十二烷基月K氨酸，0.02%十二烷基硫酸钠。必要时 可以加一些杂交促进剂，常用的有硫酸葡聚糖，它能促进DNAJ之间 的缔合，10麻酸葡聚糖存在时杂交速度可提高10-100倍，缺点是因 其相对分子质量大会引起溶液黏度大大增加。聚乙二醇（ PEG也是 常见的杂交促进剂。聚丙烯酸的钠盐，使用浓度为2%-4%优点是粘稠度低，价格低廉。一、名解1 .生物大分子：指的是作为生物体内主要活性成分的各种分 子量达到上万或更多的有机分子。 常见的生物大分子包括蛋白质、 核酸、脂类、糖类。2 .酚抽提法：最初于1976年由Stafford及其同事提

14、出，通 过改良，以含EDTA SDS及无DNA!的RNAS裂解缓冲液破碎细 胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA重复 抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需 的DNA羊品。3 .凝胶过滤层析：凝胶过滤层析也称分子排阻层析或分子筛 层析，利用凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离， 是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。4 .巢式PCR巢式PC幅一种变异的聚合酶链反应（PCR）,使 用两对（而非一对）PCRSI物扩增完整的片段。第一对PC咫I物扩 增片段和普通PCRff似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在 第一次PCRT增片段的内部）结

15、合在第一次 PCRT物内部，使得 第二次PCRT增片段短于第一次扩增。巢式 PCR勺好处在于，如 果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引 物配对并扩增的概率极低。因此，巢式 PCR勺扩增非常特异。5 . Real-time PCR实时荧光定量PCRK术是指在PCR5应体 系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR8程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。6 .变性：模板DNAS加热至94c左右5min聚合酶链式反应 时间后，使模板DNAX链或经PCRT增形成的双链DNAS离，使 之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。7 .复性：模板DNAS加热变

16、性成单链后，温度降至55c左右,引物与模板DN婵链的互补序列配对结合8 .退火：温度突然降至37-58 C时，变性的DN嶂链在碱基 互补的基础上重新形成氢键开始复性。一般退火温度比引物Tm值约低5C。二、问答1 .根据作用原理生物分子的分离纯化有那几类？答：根据作用原理生物分子的分离纯化可分为：（1）根据分子极 性大小和溶解度的不同，如溶剂提取技术、盐析法、分配层析法、分 级沉淀法等；（2）根据分子形状和大小不同，如凝胶过滤层析等；（3） 根据物质吸附性质不同，如选择性吸附与吸附层析法等；（4）根据分子带电性（电离性质）的差异，如离子交换层析、电泳、等电聚焦法 等。（5）根据配体特异性，如亲和

17、层析。2 .什么原因易引起DN解解，该如何解决？答：引起DN解解的原因有：1）材料不新鲜或反复冻融2）未 很好抑制内源核酸酶的活性3）提取过程操作过于剧烈，DNAt机械 打断4）外源核酸酶污染5）反复冻融。相应的解决方法有：1）尽量 取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融；液氮研磨或匀浆组织后， 应在解冻前加入裂解缓冲液2）在提取内源核酸酶含量丰富的材料的 DNA寸，可增加裂解液中螯合剂的含量 3）细胞裂解后的后续操作应 尽量轻柔4）所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌 5）将DNA# 装保存于缓冲液中，避免反复冻融。3 .简述PC敬术的基本原理及其反应体系的一般组成?答：PC粒术的基本原理是D

18、NA勺半保留复制，是在模板 DNA 引物和四种dNTP存在的条件下，依赖于DN膘合酶的酶促反应。在 反应中混合下列物质：模板DNA四种dNTP（包括dATP dTTP dGTP dCTP、引物1、引物2、TaqDNA!合酶、缓冲液及 Mg2+ （MgC， 然后经下列过程大量扩增靶 DNA基本的反应分变性、退火、延伸等 三步完成。4 .试分析PCRH现非特异性扩增产物的原因及解决方法？答：（1）引物特异性不高，引物用量过多，应调换引物或降低 引物用量。（2） TaqDNA!合酶质量不好或用量偏高，应降低酶量或 使用质量较好的酶。（3） Mg2裱度过高，可适当调节Mg2软度。（4） 退火温度过低，

19、退火及延伸时间偏长，可提高退火温度，减少退火及 延伸时间，或者采用二温循环PCRa行扩增。（5）热循环次数过多， 适当增加模板用量，减少循环次数。一、名解1. 代谢组学：通过考察生物体系（细胞、组织或生物体）受刺激或扰 动后（如将某个特定的基因变异或环境变化后），其代谢产物的变化 或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学。2. 毛细管电泳：是以毛细管为分离通道、采用高压直流电场为驱动力 的的新型液相分离技术，通过离子化合物的质荷比（ m/z）不同造成 迁移速率不同来实现分离。3. NMR即核磁共振技术，是基于具有自旋性质的原子核在核外磁场 的作用下，吸收射频辐射而产生的能级跃迁谱学，主要用于

20、反映化合物结构中的H和C原子的位置信息。4. gene therapy :基因治疗将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其 在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。5. stem cell :干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一 定条件下，它可以分化成多种功能细胞。6. CRISPR/Cas system： （clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated （Cas） ）系统广泛存在于名田菌及 古生菌中，是机体长期进化形成的 RNA指导的降解入侵病毒或噬菌 体DNA的适应性免疫系统。基于细菌的这种免

21、疫功能，人们把II型 CRISPR-Cas系统改造成一种全新的人工核酸内切酶，从而使该系统 能够对靶基因进行修饰。二、问答1 .简述代谢组学特点？答：（1）关注于内源性小分子化合物；（2）对生物体系中的小分 子化合物进行定性定量研究；（3）内源性小分子化合物的上调和下调 指示了与疾病、毒性、基因修饰或环境因子的影响；（4）内源性化合 物的特点用来表征疾病和药物筛选。2 .简述MicroRNA的生物合成过程？答：（1） miRNA基因被车录成pri-miRNA （RNA 聚合酶H）; （2） pri-miRNA 被剪切成具有 70-100 个核甘 酸 的 pre-miRNA (Drosha,DG

22、CR8); (3) pre-miRNA 从核内被转移至胞质(Exportin-5, Ran-GTP); (4) pre-miRNA被剪切成21-25个核甘酸的双链RNA双 体(Dicer,TRBP,PACT) ; (5)双链RN破体中成熟 miRNAS会选择性 整合入RISC,并与mRNAE补配对。3 .简述miRNA能研究方法？答：(1) miRNA体外或体内水平的过表达研究：构建相应的表达 载体，体外合成miRN丽体分子；(2) miRNAg达抑制研究：基因水 平抑制miRNAg达，使用反义核酸分子抑制 miRNAg达。4 . MicroRNA引发肿瘤的可能原因？答：(1) microRN

23、A与细胞的增殖、分化、凋亡密切相关，而肿瘤 则是由细胞增殖、分化、凋亡功能紊乱而引发的；(2)许多microRNA的基因位于基因组中易发生断裂、移位、 缺失等变异的区域；(3)与正常组织相比，在恶性肿瘤和肿瘤细胞株中普遍存在着 对microRNA的表达失控。5 .简述基因治疗的必备条件。答：1)分子缺陷清楚2)可以得到相应基因的克隆 3)病理生理 机制已知4)有利的风险-利益比5)治疗基因可以被调控6)合适 的靶细胞7)有效安全8)相关法规健全。6 .简述骨髓干细胞的特性。答：1)具有可移植性和自我更新能力，在体内永不耗竭，只需单次治疗；2）具有多能性，可分化为粒、红、淋巴和血小板等各种血细胞，且在分化过程中保持基因组的相对稳定，使目的基因随细胞的分化成熟而相对扩增，病人可终身受益；3）外源基因表达产物可通过血液循环遍布全身；4 ）造血干/祖细胞的功能活性可在体内外 进行分析；5）取材于自体骨髓或脐带血，易于获取也便于植回并存 活，临床已有成熟技术。7 .简述基因治疗有待解决的问题。答：1）难以获得真正有治疗作用的基因 2） 外源基因的表达 难以在体内精确调控3）体细胞经体外培养后，其生物学特性会有改 变4）过多的外源蛋白对机体带来可能的影响 5）随机整合潜在的 威胁。