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1、第五节LCMS分析条件的选择和优化一、按的选择ESI和APCI在实际应用中表现岀它们各自的优势和弱点。这使 得ESI和APC1成为了两个相互补充的分析手段。概括地说.ESI适合 于中等极性到强极性的化合物分子，待别是那些在溶液中能预先形成 离子的化合物和可以获得多个质子的大分子（蛋白质）。只要有相对强 的极性，ESI对小分子的分析常常可以得到满意的结果。APCI不适合可带有多个电荷的大分子，它的优势在于非极性或 中等极性的小分子的分析。表33从不同的方面对二者进行了比较，可 以帮助我们针对不同的样品、不同的分析目的选用这两种接口。3-3 ES1#QAPC1 的比较比较项目ESIAPCI可分析样
2、品蛋白质、肚类、低聚核音酸$儿茶 酚胺、季餒盐墊含杂原子化合物 如氮基甲酸酩命冋用热畋冥分析 的化合物非极性/中等极性的小分子如 脂肪酸邻苯二甲酸尊$含杂原子 化合物如気基甲酸酯、專等可用 热喷粒子束枝术分析為化合物不能分析样品极端非极性样品非挥发性样品热稳定性建的样 品基虞和淹动相 的形响对样品的基质和流动相组成比 APCI更钦感，对挥发性很*的缓 冲秽也要求他用较低的浓度出现 cr .cfjCOct 等薦子的 加成对样品的基质和流动相组成的 敏感程度比ESI小可以使用稻高 浓度的挥发性強的缓冲液$有机溶 剂的种类和涪剂分子的加成形响 离子化效率和产物溶剂溶刑jH対在溶剂中形成科子的 分析物
3、有童大的形晌;溶剂pH的 调猿会加強在溶液中非离子化分 析物的离子化效率瘠刑选律非常畫要并形响离于 化过復卜溶剂pH对离子化效率有 一定的形响盛动相流速在低渡速（V100/11下工作良好； 高底速下750pl）比APC1差在低流速（100pl）下工作不好； 在高流連下（750川）好于ESI碎片的产生CID对大部分的极性和中等极 性化合物可产生显著的碎片比ESI更为有效并常有脱水峰 出现二、正、负离子模式的选择般的商品仪器中，ESI和APCI接口都有正负离子测定模式可 供选择。选择的一般性原则为：（1）正离子模式 适合于碱性样品，如含有鞭氨酸、精氨酸和组 氨酸的肽类。可用乙酸（pH=34或甲酸（
4、pH = 23）对样品加以 酸化。如果样品的PK值是已知的，则pH要至少低于pK值2个单位。（2）负离子模式适合于酸性样品，如含有谷氨酸和天冬氨酸的 肽类可用氨水或三乙胺对样品进行减化。pH要至少高于pK值两 个单位。样品中含有仲氨或叔氨基时可优先考虑使用正离子模式，如果样 品中含有较多的强负电性基团，如含氯、含澳和多个径基时可尝试使 用负离子模式。有些酸碱性并不明确的化合物则要进行预试方可决定, 此时也可优先选用APCK + ）进行测定。三、潦动相和流的选择ESI和APCI分折常用的流动相为甲醇、乙騰、水和它们不同比例 的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液，如甲酸鞍、乙酸镀等HPLC分 析中常用
5、的磷酸缓冲液以及一些离子对试剂如三氟乙酸等要尽量避免 使用，不得已时也要尽量使用低浓度。流量的大小对LC-MS成功的联机分析十分重要。要从所用柱子 的内径、柱分离效果、流动相的组成等不同角度加以通盘考虑。即使 是有气体辅助设置的ESI和APCI接口也仍是在校小的流量下可获得 较髙的离子化效率，所以在条件允许的情况下最好采用内径小的柱子。 从保证良好分离的角度考虑，0.3mm内径的液相柱在10/xl/min左右 的流量下可得到良好分离.1.0mm的内径，要求30GO/min的流 量，2lmm的内径要求200500pd/min的流量，而46mm的内径则 在700pl/min的流量下方可保证其分离度
6、。采用2lmm内径的柱 子.用3004000/min的流量，流动相中的有机溶剂比例较高时.可 以保证良好的分离及陀级的质谱检出。这在般的样品分析中是一个 比较实用的选择。同样流量下的流动注射分析比柱分离联用可得到更强的响应值 这是由于没有色谱柱洗脱损失所致。实践工作中可根据样品的纯度灵 活地选用流动注射或柱分离方式。四、週度的选挣ESI和APCI操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥气体 而言。一般情况下选择干燥气体温度高于分析物的沸点2（rc左右即 可。对热不稳定性化合物，要选用更低些的温度以避免显著的分解。选 用干燥气体温度时要考虑流动相的组成.有机溶剂比例髙的可采用适 当低些的温度。此
7、外，干燥气体的设定加热温度与干燥气体在毛细管 入口周围的实际温度往往是不同的，后者要低一些，这在温度设定时 也要考虑到。五、系统背量的消除与GC-MS相比，LC-MS的系统噪声要大得多，它产生于大量的 溶剂及其所含杂质直接导入离子化室造成的化学噪声及在高电场中的 复杂行为所产生的电噪声。这些噪声常常会淹没信号，以至于有时在 总离子流（TIC图上无法看到峰的岀现。消除系统噪声在LC MS分 析中不是一件容易的事情.要从以下几个方面入手：（1）有机溶剂和水市售的溶剂如甲醇、乙騰等以色谱纯度的为 最好，但它们在生产中所控制的主要指标为200nm附近的紫外吸收。 对一些在ESI条件下可产生很强信号的杂
8、质并没有加以控制，例如，无 论是国产或进口试剂中经常发现很强的增塑剂（邻苯二甲酸酯）信号 协/刃49、汝/?315、加/乂391,造成很高的背景。由于目前尚无“电喷雾 纯的溶剂上市，需要自己设法加以纯化。分析中所用的水应为去离 子水并保存在塑料容器中以减少钠离子的混入。（2）样品的纯化 血样、尿样中含有大量的生物学基质，它们对 噪声的贡献在所有分析方法中都是同样存在的。因此LC-MS分析中 大量的工作仍是样品的前处理，本节的稍后部分将介绍一些较新的样 品制备枝术。采用尿液直接进样逬行LC-MS测定并不一定是个好主 意。简单的固相萃取或液一液萃取即可将尿液中的大部分杂质除掉，既 保护了分离柱又降
9、低了背景。（3）系统清洗大多数的“脏”样品对输液管路、喷口、毛细管入口及入口金属环等部件的污染是很严重的，尤其是蛋白质。控制进 样量和经常清洗这些部件是必要的。色谱柱的冲洗比在HPLC分析中 要更认真。输液管路最好用聚四氟乙烯（teflon）管或无色聚醛醍酮 （peek）管。不锈钢毛细管会吸附样品并造成减金属离子污染问题（过 多的加成）。（4）氮气纯度市售的钢瓶装高纯氮气（99.999%）及制氮机生 产的氮气都要进一步纯化方可使用。有条件的实验室可用顶空 （headspace）液氮罐为氮气源，其纯度更好些。六、社后补偿技术柱后补偿或柱后修饰（post-column modification）,在液相分离和离 子化要求的条件相互矛盾时常被使用。其作用为： 调整pH,以优化正、负离子化的条件，达到最高的离子化效率; 加入异丙醇可加速含水多的流动相的脱溶剂过程； 对一些没有或仅有弱的离子化位置的分子可在柱后加入乙酸 钱（50pmol/L）加强正离子化效率； 应用“TFAJix”技术解决三氟乙酸对（蛋白质）信号的压抑 作用； 在毛细电泳与ESI接口联用时，用来增加流量； 利用柱后三通分流 加入衍生化试剂，做柱后衍生化。