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1、PCF反应体系有关的过程姓名： 于烨敏学号：11243220班级：113第一部分1、PCR原料：DNA模板：模板包含要用来扩增的靶基因区域，适当提高模板浓度， 可减少循环次数，从而减少突变的发生和非特异性产物的形成；但过高的模板浓度会降低反应效率。上游引物和下游引物：是人工合成的短的单链 DNA片段(寡核苷酸)，经常由18-30个碱基组成，用来确定扩增区域 的起止位点从而确定扩增的 DNA片段大小；物与要扩增的双链DNA的两端精确互补，在退火 中可以与DNA莫板链特异性地结合。当引物与模板链结合后，DNA聚合酶就开始从引物链的结合位点催化合成新的 DNA链。引物的量不能太多，过多的引物导致非特
2、异性扩增的发生和 引物二聚体的形成。聚合酶：聚合酶从引物结合位点开始沿DNA链移动，阅读DNA编码信息，填充正确的匹配核苷酸，催化DNA新链的合成；来源于生活在热泉中的一种细菌Thermus aquaticus的Taq聚合酶是目前使用最广泛的聚合酶。由于Taq酶没有3-5外切酶活性，在复制 DNA的过程中可能会随机的引入错误的碱基。 对于一般的PCF实验来讲，错误的产生不影响实验的结果；但特定的实验，如扩增的序列是用在测序或蛋白表达等用途时最好使用有较读活性的高保真酶，如Tli或Pfu。由于Taq酶相比其它酶要求的反应条件简单，扩增效率较高，因此可同其它酶 混合起来以提高扩增长片段时的保真性。
3、单独使用高保真酶扩增的产物如果与具有黏性末端的载体相连前，通常利用 Taq酶在产物的3末端增加一个多余的 A碱基。四种 dNTP( dATP, dCTP dGTP和 dTTP):是合成DNA新链的原料。dNTP的量与合成产物的大小有关，越长的片段需要越多的dNTP但过多的dNTP能增加复制的错误率并可能抑制Taq酶活性。缓冲液：为维持DNA聚合酶的活性提供必要的pH值和离子浓度。Mg离子:Mg离子对于维持聚合酶的活性是必须的，它通过稳定引物-模板相互作用而影响退火进程；同时也能稳定聚合酶同引物一模板形成的复制复合物，因此可以增加非特异性退火，进而形成非特异性产物。许多成分如EDTA和dNTP可
4、以结合一部分Mg离子，所以Mg离子准确的用 量需要实验来确定。一般来讲，低浓度的Mg离子增加复制的可信度，而高量的Mg离子降低 特异性、引入突变。一般反应可通过变化温度、模板质和量而规避提高Mg量的操作。添加剂:当模板GC1.7-deaza-dGTP, Glycerol (5-10%), formamide (1-5%) or DMSO (2-10%)含量高时，加入7-deaza-dGTP或DMSO可以降低互补碱基间的氢键从而降低反应需要的有效 退火温度和变性温度。这些添加剂也会改变聚合酶的耐热性，Glycerol可保护聚合酶，防止热失活；而formamide可降低酶的耐热性。2. 0.5-2
5、M Betaine :当模板GC含量高时或扩增长片段时， 加入后可降低变性温度到 92-93 C, 并使退火温度下降2-3 C, Betaine经常跟5 %的DMS(一起使用。3. TMAC (tetramethylam monium chloride), TEAC (tetraethylam monium chloride), andTMANO (trimethlami ne N-oxide);4. BSA :可以提高 PCR反应效率。5. Triton X-100:可防止聚合酶的相互缔合或者黏附在反应管壁上2、图形原理:|話t赴火111塔 | _ 靈 I ，二应 J3，皿贸牺twi环I3、
6、DNA聚合酶说明书：第二部分选取目的基因的具体来源Escherichia coli plasmid pNGX2-Q nrS1, completesequenee（定义）DEFINITIONEscherichia coli plasmid pNGX2-Q nrS1, completeseque nee. ACCESSIONVERSIONDBLINKKEYWORDSSOURCEORGANISMNC_019047 REGION: compleme nt(7133.7555)NC_019047.1GI:410488804Project: 178640BioProject: PRJNA178640Ref
7、Seq.Escherichia coliEscherichia coliBacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; En terobacteriales; En terobacteriaceae; Escherichia.REFERENCE 1 (bases 1 to 423)AUTHORSJohnson,T.J., Bielak,E.M., Fortini,D., Hansen,L.H., Hasman,H.,Debroy,C., Nolan,L.K. and Carattoli,A.TITLEExpansion of the IncX pl
8、asmid family for improved identificationand typ ing of no vel plasmids in drug-resista nt En terobacteriaceae(改进的识别和耐药肠杆菌科新型质粒分型的相应质粒家庭的扩张)JOURNAL Plasmid 68 (1), 43-50 (2012)PUBMED 22470007REFERENCE2 (bases 1 to 423)CONSRTMNCBI Genome ProjectTITLE Direct Submissi onJOURNAL Submitted (01-NOV-2012) N
9、atio nal Center for Biotech nologyInformation, NIH, Bethesda, MD 20894, USAREFERENCE 3 (bases 1 to 423)AUTHORS Johnson,T.J., Bielak,E.M., Fortini,D., Hansen,L., Hasman,H.,Debroy,C., Nolan,L.K. and Carattoli,A.TITLE Direct Submissi onJOURNALSubmitted (09-DEC-2011) Departme nt of In fectious, Parasiti
10、c andImmuno-Mediated Diseases, Istituto Superiore di Sanita, Rome,ItalyCOMMENT to finalFEATURESsourcegenePROVISIONAL REFSEQ: This record has not yet bee n subjectNCBI review. The reference seque nee is ide ntical to JQ269335. COMPLETENESS: full len gth.Locati on/Qualifiers1. 423/orga ni sm二Escherich
11、ia coli/mol_type=ge no mic DNA/strai n=Z7/host二poultry/db_xref二taxon :562/plasmid二pNGX2-Q nrS1/co un try二Nigeria: Ibada n1. 423/locus_tag=D616_p1010/db_xref=Ge nelD:13903681二、大肠杆菌质粒DNA勺提取：1、 碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒 DNA可直接用于酶切、PCR 扩增、银染序列分析。方法如下：(1 )、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于 2ml LB培 养基。(2) 、37C振荡培养过夜。(3) 、
12、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min,弃上清液。(4) 、力口 0.1ml 溶液 1(1 %葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0, 25mM/L Tris-HCl pH8.0) 充分混 合。(5) 、加入0.2ml溶液ll(0.2 mM/L NaOH , 1 % SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴 5 min 。(6) 、加入0.15m1预冷溶液lll(5 mol/L KAc , pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min。(7) 、以10, 000rpm离心20min，取上清液于另一新 Ep管(8) 、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0 C静置10min。(9) 、再
13、以10, 000rpm离心20min，弃上清。(10) 、用70%乙醇0. 5ml洗涤一次，抽干所有液体。(11) 、待沉淀干燥后，溶于 0. 05mlTE缓冲液中2、煮沸法(1 )、将1.5ml培养液倒入 eppendorf管中，4C下12000g离心30秒。(2) 、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。(3) 、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中，涡旋混匀。、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml),涡旋振荡3秒钟。(5)、将eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。、用微量离心机4C下12000g离心10分钟。、用无菌牙签从eppendof管中去除细菌
14、碎片。（8）、取20ml进行电泳检查。注意1.对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。2.煮沸法中添加溶菌酶有一定限度，浓度高时，细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶菌。3.提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验，如限制性内切酶消 化,亚克隆及连接反应等。【质粒DNA的大量提取和纯化】在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。大量提取的质粒 DNA 一般需进一步纯化，常用柱层析法和氯化绝梯度 离心法。（一）、碱法1、 取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml, 4C下5
15、000g离心15分钟, 弃上清，将离心管倒置使上清液全部流尽。2、 将细菌沉淀重新悬浮于 50ml用冰预冷的STE中（此步可省略）。3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。4、将细菌沉淀物重新悬浮于 5ml溶液I中,充分悬浮菌体细胞。5、 加入12ml新配制的溶液II,盖紧瓶盖，缓缓地颠倒离心管数次，以充分混匀内容物，冰 浴10分钟。6、 加9ml用冰预冷的溶液 山，摇动离心管数次以混匀内容物，冰上放置15分钟，此时应形 成白色絮状沉淀。7、4C下5000g离心15分钟。8、取上清液，加入50ml RNA 酶A（10mg/ml）, 37 C水浴20分钟。9、 加入等体积的饱和酚/氯仿，振荡混匀，4
16、C下12000g离心10分钟。10、取上层水相，加入等体积氯仿，振荡混匀，4C下12000g离心10分钟。11、取上层水相，加入1/5体积的4mol/L NaCl和10% PEG（分子量6000）,冰上放置60分钟。12、 4C下12000g离心15分钟，沉淀用数 ml 70%冰冷乙醇洗涤，4C下12000g离心5分 钟。13、真空抽干沉淀，溶于 500ml TE或水中。 注意1.提取过程中应尽量保持低温。2. 加入溶液II和溶液III后操作应混和，切忌剧烈振荡。3. 由于RNA酶A中常存在有DNA酶，利用RNA酶耐热的特性，使用时应先对该酶液 进行热处理（80C 1小时）,使DNA酶失活质粒
17、DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，应选用电泳纯的，琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙锭染色后荧光背景最小。（1）琼脂糖凝胶电泳装置由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高，而适应性又强，使用最普遍的装置是WalterSchaffner发明的水平板凝胶。（2）琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。然后将熔化液倒入胶模中，令其固化。凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。通贯凝胶的电场接通后，在中性pH值下带负电荷的 DNA向阳极迁移。（3）琼脂糖凝胶的染色电泳完毕，将琼脂糖凝胶转移入含EB的染液中，染色
18、10分钟，取出紫外灯下观察。三LB培养基制备（液体）：LB培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。它含有 酵母提取物、蛋白胨和NaCI。其中酵母提取物为微生物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而 NaCI提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。 琼脂在常用浓度下96C时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40C时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。
19、LB培养基的配方如下：酵母提取物5g蛋白胨10gNaCl5g琼脂1520g水 1000mLpH 7.4 7.6三、器材酵母提取物，蛋白胨，NaCl，琼脂；1mol/L NaOH , 1mol/L HCl ;试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸（pH 5.59.0 ）,棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。四、操作步骤1 .称量按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物、蛋白胨、NaCI放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称 取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。2
20、. 溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。3. 调 pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始 pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中 逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.6。反之，则用1moI/L HCI进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内 各离子的浓度。对于有些要求pH值较精确的
21、微生物，其pH的调节可用酸度计进行(使用方法，可参考有关 说明书)。4分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。(1) 液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。(2) 固体分装分装试管， 其装量不超过管高的1/5 ,灭菌后制成斜面，分装三角烧瓶的量以不 超过三角烧瓶容积的一半为宜。(3) 半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。5. 加塞培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。6. 包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好
22、，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外 包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好， 使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。7. 灭菌将上述培养基以1.05kg/cm2 (15磅/英寸2),121.3 C, 20分钟高压蒸汽灭菌。 如因特殊情况 不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。&搁置斜面将灭菌的试管培养基冷至 50C左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。9.无菌检查将灭菌的培养基放入37C的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。四：DNA电泳之做胶实验步骤
23、：用1 XTAE -Buffer按照被分离 DNA分子的大小配制一定浓度 (0.7%)的琼脂糖凝胶50ml , 在微波炉中加热至琼脂糖溶解。待溶液冷却至50 C左右，加入溴化乙锭(贮存液：用水配制为1mg/ml )至终浓为0.5mg/ml充分混匀。(3) 用透明胶封固玻璃板两头，在距底板0.51.0mm的位置上放置梳子，将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度在35mm之间。(4) 在凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心地将玻璃板移至装有1 XTAE缓冲液的电泳槽中，轻轻地拔去梳子，且使缓冲液没过胶面约1mm。DNA样品与10 Loading-buffer(含有溴酚蓝和甘油等物质)混合后，用微量取样
24、器慢慢将 混合物加至样品槽中。 盖上电泳槽并通电，使 DNA向阳极(红线)移动，采用电压为80100V。(7)溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后切断电流，取出玻璃板，在紫外灯下观查凝胶。(注：对于DNA片段回收的电泳一般建议采用0.6%低浓度的凝胶，而且采用的电泳液需第一次使用，电泳槽要洗净)【琼脂说明书】琼脂(Agar),商品名琼胶。可用作增稠剂、凝固剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、保鲜 剂、粘合剂和生物培养基。本药品被归类到其他类等药品分类。琼脂的用法用量注意：同种药品可由于不同的包装规格有不同的用法或用量。本文只供参考。如果不确定，请参看药品随带的说明书或向医生询问。琼脂在食品工业的应用中具有一种
25、极其有用的独特性质。其特点：具有凝固性、稳定性，能与一些物质形成络合物等物理化学性质，可用作增稠剂、凝固剂、悬浮剂、孚L化剂、保鲜剂和稳定剂。广泛用于制造粒粒橙及各种饮料、 果冻、冰淇淋、糕点、软糖、罐头、肉制品、 八宝粥、银耳燕窝、羹类食品、凉拌食品等等。琼脂在化学工业、医学科研、可作 培养基、药膏基及其他用途。琼脂成分或处方(C12H18O9 )n琼脂贮藏方法密封保存市场上的琼脂第三部分一、克隆载体与表达载体的区别克隆载体一般是原核细菌 将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接 在导入原核细 菌内质粒会在原核细菌内大量复制 形成大量的基因克隆 被克隆的基因不一定会表达 但一 定被大量复制。表
26、达载体是一些用于工程生产的细菌他们被导入目标基因 这些目标基因会在此类细菌中得到表达 生产出我们需要的产物 导入的基因是有克隆载体产出的。克隆载体最基本的要求是：具有自主复制能力， 否则目的基因就无法进行克隆；携带易于筛选的选择标记，用于筛选成功的重组DNA淘汰未重组的空载体；载体应尽可能小，便于导入细胞和进行繁殖；使用安全。1、pMD18-T Vector 说明书制品说明pMD?18-T Vector 是一种高效克隆 PCR产物(TA Cloning )的专用载体。本载体由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了 EcoR V识别位点，
27、用 EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的 3端添加“ T”而成。因大部分耐热 性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在 PCR产物的3末端添加一个“ A”的特性，所以 使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。由于本载体以pUC18载体为基础构建而成，所以它具有同pUC18载体相同的功能。此外，本制品中的高效连接液Solution I可以在短时间内(约30分钟)完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。本制品中的Control Insert ( 500 bp)还可以用于Control反应。制品内容pMD?18-T Vector (50 ng/ l) 20 卩 l x
28、 1 支 Control Insert ( 50 ng/ 卩 l) 10 卩 l x 1 支 Solution I* 75卩l x 2支*使用时请于冰中融解。保存：-20C纯度 Control Insert经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA片段。用途进行TA克隆，克隆PCR产物。对克隆后的 PCR 产物使用 BcaBESTTM Sequencing Primers、M13 Primers 进行 DNA 测 序。 pMD?18-T Vector 的结构pMD18-T Vector的结构IGAGCGrGATAAATITCGGAAACGCl-ATCATGATTAArTCCTC
29、TCGGTCCTCTAXSAGATATCTCGAjCCTSCAGGCATGCAAGCTTOUCACTQClHCCaTCarr T TKMCaTCOCWCT&CWJAAAACCCT&QCa CAMACTQACCCTTTTGG&ACCeCScaBf $厂 Soquqncwifl Primer Ml 3tOgesM by EceR, VfT-Clenmgta)i v agfettiT g v e$teAee g I：c Ic fe4 TI *gicgcl gg【pMD?18-T Vector相关位点说明】Clo ning site425BcaBEST Seque ncing Primer M13-4
30、7 bin di ng site352375BcaBEST Seque ncing Primer RV-M bin di ng site484507LacZ operator146475ColE1 ori8731461Ampr16322492实验操作 Control DNA片段的克隆实验A）操作方法1）在微量离心管中配制下列 DNA溶液，全量为5卩l。试剂使用量pMD?18-T Vector*11卩lCon trol In sert*21卩ldH2O3卩l2）力口入5卩l （等量）的 Solution I。3）16C反应30分钟。注）室温（25C）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。5分
31、钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。4） 全量（10卩I）加入至100卩I JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。5） 42C加热45秒钟后，再在冰中放置 1分钟。6） 加入890卩I SOC培养基，37 C振荡培养60分钟。7）在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝 色菌落。8） 挑选白色菌落，使用 PCR法确认载体中插入片段的长度大小。B）结果使用Control Insert时的连接/转化结果如下，使用的感受态细胞的转化效率为：1.5 x 108 cfu/卩g pUC19 DNA。Con trol Insert连接/转化效率(cf
32、u/g Vector)白色菌落比率（%）效率（%） *+1.7X 10698.190以上1.1 x 10540.40*效率是指白色菌落中的目的DNA Insert片段的连入效率。 一般DNA片段的克隆实验1）在微量离心管中配制下列 DNA溶液，全量为5卩l。试剂使用量pMD?18-T Vector*11 i lIn sert DNA*30.1 pmol 0.3 pmoldH2Oup to 5 i l2）力口入5卩l （等量）的 Solution I。3）16C反应30分钟。 注） 室温（25 C）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降 低。5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。长片段
33、PCR产物（2 kbp以上）进行DNA克隆时，连接反应时间请延长至数小时。4）全量（10卩l）加入至100卩l JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。5） 42C加热45秒钟后，再在冰中放置 1分钟。6）加入890卩l SOC培养基，37 C振荡培养60分钟。7）在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。8）挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。 一种可供选择的快速克隆法 *41）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5卩l。试剂使用量pMD?18-T Vector*1 1 卩 lInsert DNA*3 0.1 pm
34、ol 0.3 pmoldH2Oup to 5 l2） 力口入5卩l （等量）的 Solution I。3）16C反应30分钟。注） 室温（25 C ）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 长片段PCR产物（2 kbp以上）进行DNA克隆时，连接反应时间请延长至数 小时。取 2 I 上述连接液 （10 ng Vector DNA ）加入到 microcentrifuge tubes 中，冰上冷却 2 min。 取 50 i l E.coli JM109 Compete nt Cell 加入到上述 microce ntrifuge tubes
35、 中，混匀并冰浴5 min。6）在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养（平板使用前需要在37C预热30分钟），形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。*1 pMD?18-T Vector 的使用量取0.5 i l实验也可得到满意的结果。实际操作时，可按实验需要确定T载体的使用量。pMD?18-T Vector 1 卩 l （50 ng）的摩尔数约为 0.03 pmol。*2 Con trol In sertControl Insert 为 500 bp 的 3末端带有 A 碱基的 PCR 产物，Control Insert 1 11 （50 ng）的 摩尔数约为 0.15 pmo
36、l。*3 Insert DNA的使用量在进行克隆时， Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为：1: 210。*4快速克隆法该克隆方法的效率会有所下降，但此方法操作简单、迅速，是一快速克隆DNA片段的方法，可以满足一定客户的需求。相关说明1. 感受态细胞的选择。转化时请使用高效的热转化感受态细胞（转化效率1 X 108 cfu/1 g pUC19 ）,这样才可能得到比较理想的阳性克隆。 如果需要进行蓝白筛选时，宿主细胞必须具有正确的基因型（F编码的LacZ M15 ）产生 3 Fragment，才可能和载体 DNA 产生的LacZ a多肽相结合， 表现出3 -半乳糖苷酶活性（a
37、 -互补性）。2. Insert DNA 的要求。Insert DNA应该进行切胶回收的纯化处理后才进行载体连接，尽量避免引物等其它杂质的存在。切胶回收时可使用TaKaRa凝胶回收试剂盒（TaKaRa Code： D301或DV805A ）。3. Insert DNA使用量的计算方法。进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的摩尔数比一般为 1: 210,我们可以根据自己的 实验情况选择合适的 Vector DNA和Insert DNA的摩尔数比。Insert DNA使用量的计算方法 如下：Insert DNA 的使用量（ng） =nmol 数X 660X Insert DNA
38、的 bp 数本载体 1 i l （50 ng）的摩 尔数约为0.03 pmol。4. 阳性克隆的检测。DNA片段成功插入至pMD?18 Vector中后，一般情况下3 -半乳糖苷酶的表达将受到破坏， 重组克隆体在含有 X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养时将显示白色菌落。但 有时比较短的 DNA片段插入载体时，基因的读码框有可能正好与LacZ的读码框相吻合，克隆体也会显示蓝色菌落。有报道称，2 kbp的DNA片段插入到载体中后，重组克隆体仍显示了蓝色。所以，当我们没有得到白色菌落时，可以试着检测蓝色菌落。进行阳性克隆检测时，我们建议使用 PCR的方法，扩增用引物可以使用Bca
39、BESTTM Sequencing Primers ,可以对菌体直接进行 PCR扩增。5阳性对照实验。为了确认实验操作的正确性以及实验试剂的有效性，我们建议进行阳性对照实验。按照实验操作方法，使用试剂盒中提供的Control Insert，可以进行10次阳性对照实验。6.转化效率的计算。取0.1 ng的pUC19 Plasmid DNA 加入至100卩l的热转化感受态细胞中后，再加入 900卩l 的SOC培养基（0.1 ng DNA/ml ）,将上述培养液稀释 10倍后（0.01 ng DNA/ml ）取100卩l 涂布平板（0.001 ng DNA/100卩l）,记录菌落数。以得到 200个
40、克隆体为例计算转化效率， 此时的转化效率 =200 cfu/0.001 ng=2 x 105 cfu/ng=2 x 108 cfu/ 卩 g pUC19 DNA。使用注意1. Solution I请于冰中融解。2. 克隆时使用的Insert DNA片段（PCR产物）建议进行切胶回收纯化，否则PCR产物中的短片段DNA （甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段）、残存引物等杂质都会影响 TA克隆效率。3.按照本实验操作进行连接后， 直接进行转化时的连接液不要超过 20卩l。当要转化的 DNA量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀，纯化DNA后再进行转化。进行乙醇沉淀时使用核酸共沉剂（Ta
41、KaRa Code： D605A ）可以提高DNA的回收率。4.连接反应请在25C以下进行，温度升高（26 C）较难形成环状 DNA。连接效率偏低时， 可适当延长连接反应时间至数小时。5.本制品来源于pUC18载体，因此，适合pUC18载体的感受态细胞都可以使用,如：JM109等。2692399-461425146-47516322492873-1461PMD18-T的序列 pMD18-T Vector Positi ons of various eleme nts Vector size (bp)Multiple clo ning siteClo ning SiteLacZ a -pepti
42、deAmpicilli n resista nee gene pUC origi nprimer binding sites :BcaBEST Seque ncing Primer M13-47 binding site352-375BcaBEST Seque ncing Primer RV-M bin di ng site484-5071 TCGCGCGTTT CGGTGA TGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG51 GAGACGGTCA CAGCTTGTCT GTAAGCGGA T GCCGGGAGCA GACAAGCCCG101 TCAGGGCGCG
43、TCAGCGGGTG TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG151 CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC ACCATATGCG GTGTGAAATA201 CCGCACAGA T GCGTAAGGAG AAAA TACCGC ATCAGGCGCC ATTCGCCATT251 CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTA T301 TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA351 ACGCCAGGGT TTTCCCA
44、GTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGCCAA401 GCTTGCATGC CTGCAGGTCG ACGA TtATCTC TAGAGGATCC CCGGGTACCG451 AGCTCGAATT CGTAA TCATG GTCA TAGCTG TTTCCTGTGT GAAATTGTTA501 TCCGCTCACA ATTCCACACA ACATACGAGC CGGAAGCATA AAGTGTAAAG551 CCTGGGGTGC CTAATGAGTG AGCTAACTCA CA TTAATTGC GTTGCGCTCA601 CTGCCCGCTT TCCAGTCGGG A
45、AACCTGTCG TGCCAGCTGC ATTAATGAAT651 CGGCCAACGC GCGGGGAGAG GCGGTTTGCG TA TTGGGCGC TCTTCCGCTT701 CCTCGCTCAC TGACTCGCTG CGCTCGGTCG TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA751 TCAGCTCACT CAAAGGCGGT AA TACGGTTA TCCACAGAAT CAGGGGATAA801 CGCAGGAAAG AACATGTGAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC AGGAACCGTA851 AAAAGGCCGC GTTGCTGGCG TTTTTCCAT
46、A GGCTCCGCCC CCCTGACGAG901 CATCACAAAA A TCGACGCTC AAGTCAGAGG TGGCGAAACC CGACAGGACT951 ATAAAGATAC CAGGCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG1001 TTCCGACCCT GCCGCTTACC GGATACCTGT CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA1051 AGCGTGGCGC TTTCTCA TAG CTCACGCTGT AGGTATCTCA GTTCGGTGTA1101 GGTCGTTCGC TCCAAGCTGG GCTGTGTGCA CGAA