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1、蛋白质浓度的测定一紫外吸收法1. 近紫外吸收光谱法(280 nm)原理： 蛋白质中含有色氨酸与酪氨酸残基，这两种氨基酸残基具有吸收紫外光的性质，它们的紫外光吸收谱峰值在280 nm 附近。某些蛋白质含有二硫键，也会在 280 nm 附近吸收紫外光。近紫外吸收法就是根据这个性质，对蛋白质进行定量。 因为不同的蛋白质中所含有的色氨酸与酪氨酸的数量存在很大的差异，所以蛋白质在280 nm处的吸光度A280也存在非常大的差异。比如，当蛋白质浓度为1 mg/ml时，吸光度A280可为0-4之间的任何值。但是，大部分的蛋白质的吸光 度A280时0.5-1.5之间的某个值。该方法测定蛋白质的浓度具有明显的优
2、缺点。这种方法操作简单，测定完成后，样品可以被回收，对 buffer 没有特殊要求，这是该方法的优点。该方法的缺点是：其他的生色基团会影响蛋白质吸收光谱的测定，比如核酸在该波长的紫外吸收能力非常强，少量的核酸就会对蛋白质吸光值的测定造成很大的干扰。同时， 不同的蛋白质的消光系数需要在实验前确定。蛋白质浓度的计算：朗伯比尔定律：A (absorbance) =,帆此:c (mg/ml) = A/ l (cm)消光系数：当蛋白质浓度为1 mg/ml,光径为1 cm时，所测得的吸收值为该蛋白 质的消光系数。蛋白质的消光系数计算公式： A280 (1 mg/mL) = (5690n w + 1280n
3、y + 120nc)/M。其中 M 为蛋白质分子质量，5690、 1280 与 120 分别是色氨酸、酪氨酸与半胱氨酸的消光系数，n 是该氨基酸残基的数目。2. 远紫外吸收光谱法在 190-210 nm 范围内，蛋白质中的肽键具有非常强的吸收紫外光的能力。此波长范围内，肽键在190 nm 处的吸收值是其在205 nm 的 2 倍，而且在190 nm，氧气对紫外光的吸收非常强，因此，通常取205 nm 处的吸收值对蛋白质进行定量。对于1 mg/ml 的蛋白质溶液，它们的消光系数通常在30-35 之间。对于不同的蛋白质，其消光系数差别很小。该方法的优点是操作简单，灵敏度高，样品可以回收。缺点：在使
4、用前，必须对分光光度计进行准确校正，多种 buffer, heme or pyridoxal groups在该波长具有很强的吸收紫外光的能力。测定：1 .用生理盐水溶解蛋白质样品，确保其在215 nm处的吸收值小于1.5。2 . 磷酸钾 buffer 不影响吸收值的测定。3 .计算公式：A2051 mg/mL = 27 + 120 (A280/A205)或 Protein concentration ( g/mL)=144 (A215 A225) oNotes:1 . 使用这两个方法进行蛋白质定量时，最佳的吸收值范围为0.05-1，当吸收值为 0.3时，测定的结果最精确。2 .如果样品浑浊，可
5、以扣除310 nm处的吸收值。3 .当蛋白质浓度很低时，蛋白质可能会吸附在石英杯内壁，从而影响蛋白质浓度的测定，在溶液中提高离子强度或者添加非离子型去垢剂可以防止这种现 象的发生。4 . 1mg/ml的BSA的吸收值为0.06,通常作为蛋白标准品。5 .当溶液中存在核酸时，可以用下列公式计算蛋白质浓度：Protein (mg/mL) = (A235 A280)/2.51Protein (mg/mL) = (A235 -A28o)/2.51Protein (mg/mL) = 0.183 A230 0.0758A2606 .当吸收值小于2时，在215 nm处测定的吸收值符合朗伯比尔定律。7 . 在
6、 215 nm处进行测定时，sodium chloride, ammonium sulfate, borate, phosphate, and Tris 不会影响吸收值的测定，但是 0.1 M acetate, succinate, citrate, phthalate, and barbiturate具有很强的吸收值。8 .在pH4-8的范围内，215 W25 nm的吸收值没有变化。9 .当蛋白质中存在核酸时，也可以这样计算：protein concentration (in mg/ml) =Fx Z280 (assuming the cuvette is 1 cm wide).fropar
7、fjoii at桁皿露心nucieic a国(%)1 751桶1 521 4013*1 301251 1*1 09TO30 9790 9390 G7J0 460昭0 80J0侬 Q. 76 70乃3a 7300.70506H0 6440 6150映oofcMso.0.5D5D0 I.CM,2,SH o.1 1 1 _2-尔.00,50,W,OD.502 3 3 4 5 5ddodooddodd 255(。O o o Q o o 6.6.L7.&.0.z4.工0_i 1. 1 11 1161.0611.054 10230 W4 0 970 lingBCA仙 BSA found)Lowry aus
8、ay (pg BSA found)Waler blank corrsrctcdImerfcrcncc blank correctedWaterblank correctedImcrfbrencc blank torrccicd50 l曙 BSA m waler Ircibrtncck50.0050.000,1 VHC150,7050. KO44,2043, SOQJ VNaOH49.0049.4050.6050.600.2% Sodium azide5L1050.9049.2049.000.02 u Sodium azide51.1051.0049.5049.601,0 M Sodium ch
9、loride5L3O5L1Q50,205040100 mWEDTA (4 Na)Nd color138.505.1050 mW EDTA (4 Na)28.0029.4096.706.8010 m.WEDTA (4 Na)4KH049.1033.60J2.7O50 mW EDTA (4 Na). pH 11.253L5O3X8072.305.004,0廿 Guam dim; HCl48.304090Precipitaled3,0 5/Urea513050.1053.2045 00L0%Triton X-10050.2049.80PreeipitaiedLO%SDSaHuryl)49.2048.
10、90Precipitated1.0% Hij 355 LOU50.90Preci pilaledLQ% Lubml50.705Q.7QPrecipitated1,0% Chaps4Q9049 50PrccipimtcdL0% Chapsu5LS051.00Precipitated1.0% Oclyl gLueusidc50.905D.M0PreuipitLiied40.0% Sucrose55,4048,704.902N 9010.(1% Sucrose52.5050.5042 Q041 101.0% Sucrose51305l.2fl4H 4。48.1010。Glucose245.0057.
11、106H.1061.7050 mM Glucose144.0047.7062.7058.4010 mV CilucGse70.0()49 1052.6051.200,2 W Sorbitol42.9037.8063.700。0.2 M Sorbitol. pH 112540.7036 206K6026.601.0 A? GlycineNo color7.307,70I.OjW Glycine. pH H50.704乩9032.5027.9015 Ai Tris36.20就死10.208.SO0.25 M Tris466014 0027 9028dO0J M Tris50.R049.603H.9
12、03B.W025 M Tris, pH 1L2552,00503040.8040,8020.0.i Aniinuniurn sullale5.601.20Precipimied10.( .i Arnmuniurn sulfile160012.00PrecipilEited3.0% Ammonium sulfate44.9042.0021.2021.4010.0% Ammonium sulfalc, pl 1 1148.1045.2032.6032,802.0 A J Sodium acetate, pH 5.535.5034.505.4033。上 Af Sodium acetate. pH 5
13、.550,8050 4()47.5047 601.0 U Sodium phosphate37.10M.207.305300.1 M Sodium phosphate50.8050.4046.6046.600.1 MCesium bkarbonate49.5049.70PrecipitatedReproduced firom ref, / with permission trom Acadeniic Press Inc.1. 试剂 A 与 B 非常稳定，可以购买。2. 延长样品孵育时间可以增强灵敏度。注意要保持标准品孵育时间与样品孵育时间一致。3. 加热后，溶液颜色在1 小时内都是非常稳定的。BCA4. 样品中含有干扰物质时，可以将样品结合到尼龙膜上，然后洗掉杂质，可以与膜上的蛋白质反应。