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1、实验植物DNA提取及检测,植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测,实验植物DNA提取及检测,植物基因组 DNA的提取琼脂糖凝胶电泳检测,实验植物DNA提取及检测,一 、实验目的,学习提取和纯化高等植物总DNA的方法，理解其原理。,实验植物DNA提取及检测,脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA) 与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA,前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)和叶绿体DNA(ctDNA)。,二、实验原理,实验植物
2、DNA提取及检测,细胞破碎 抽提去蛋白质 沉淀核酸,基本过程,实验植物DNA提取及检测,机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：用SDS处理细胞； 酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。,细胞破碎,实验植物DNA提取及检测,SDS法 SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与蛋白质之间 常借静电引力或配位键结合, SDS能够破坏这种价键。CTAB法 CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。,DNA提取,实验植物DNA提取及检测,蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊
3、醇（24：1）抽提。RNA 常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分子的RNA。酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。,DNA纯化（去杂质）,实验植物DNA提取及检测,实验材料植物叶片(去叶脉)试剂 2CTAB抽提液（CTAB、Tris-HCL、EDTA、Nacl）TE 缓冲液(pH=8.0) 氯仿：异戊醇(24:1)巯基乙醇异丙醇70%乙醇,三、材料与试剂,实验植物DNA提取及检测,离心机 水浴锅研钵 微量移液器,仪器用具,实验植物DNA提取及检测,移液器量程的选择,实验植物DNA提取及检测,1取 2g 清洗凉干的植物幼嫩叶片于研钵中，加 入液氮，迅速研磨。将2CTAB抽
4、提液与2ml巯基乙醇在提取前混合后于65水浴中加热30分钟。2将 0.5mL 研磨液转入 1.5mL 离心管中，加入1ml CTAB提取液，置于65水浴中保温 30min，其间颠倒混匀23次。破碎细胞3. 加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）混合液，充分颠倒混匀20分钟，防止成团。8000r/min，离心 5min，取上清。抽提去蛋白4将上清液移入新的1.5mL离心管内，加 等体积异丙醇（预冷）。颠倒混匀，可见 DNA 絮状沉淀。沉淀核酸58000r/min，离心 1min，倒掉上清液，将离心管倒置干燥。 将沉淀回溶于无菌水或 TE 缓冲液待测。,四、操作步骤,实验植物DNA提取及检测,1)选取
5、新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与 CTAB 抽提液充分混匀；2)若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇（25），尽可能选取幼嫩的材料；3）收集 CTAB 与核酸形成的复合物时不要离心过度，否则沉淀再溶解难；4）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。,五、注意事项,实验植物DNA提取及检测,六、作业,为了获得高质量的植物总DNA，在分离提取过程中应注意那些问题？,实验植物DNA提取及检测,琼脂糖凝胶电泳检测DNA,一、实验目的 学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和
6、技术。,实验植物DNA提取及检测,DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。,二、实验原理,实验植物DNA提取及检测,琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,实验植物DNA提取及检测,三、实验仪器和试剂,仪器电泳仪电泳槽灌胶模具等,实验植物DNA提取及检测,Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE）,常用电泳缓冲液,实验植物DNA提取及检测,电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。 作用：增加样品比重，
7、以确保DNA均匀沉入加样孔内。形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。使样品呈色，使加样操作更方便。,上样缓冲液,实验植物DNA提取及检测,溴化乙锭（EB） 是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng。 EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。GoldViewTM: 是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，采用琼脂糖电泳检测DNA时，GoldViewTM与核酸结合后能产生很强的荧光信号，其灵敏度与EB相当，使用方法与
8、之完全相同。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，而单链DNA呈红色荧光。GoldView不仅能染DNA，也可用于染RNA。,核酸染色剂,实验植物DNA提取及检测,DNA分子量标准,实验植物DNA提取及检测,不同种类DNA Marker,实验植物DNA提取及检测,1.凝胶制备 制备1%琼脂糖凝胶。称取0.8g琼脂糖加入 80mL 1TAE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60 时，加入 EB或GoldViewTM 10ul。缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。2.加样 取15l DNA样液与 2l 上样 buffeer 混匀，用微量移液器小心加入样品槽。3.电泳 接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为15V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）,待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳。4.观察拍照,四、操作步骤,实验植物DNA提取及检测,实验植物DNA提取及检测,实验植物DNA提取及检测,