《RNA提取方法.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《RNA提取方法.doc（1页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、RNA 提取方法（ TRIzol 法）一、试剂准备1、TROzlo 试剂、氯仿、 75% 乙醇（ 0.1% DEPC 配制）。2、塑料器皿需用 0.1% DEPC 水浸泡。3、0.1%DEPC水：100ml dd水中加入 DEPCO.Iml，充分振荡，37C孵育12h以上，121 C高压灭菌 20min , 于4C保存。二、操作步骤1 、 样品处理（1）组织：50-100mg组织中加入 1ml TROzIo试剂。（2）单层细胞：加入 TROzIo试剂1ml/cm2平板。（3）悬浮细胞：处理前洗涤细胞，以防止RNA降解。每5-10 X 105动物、植物或酵母细胞，或1X 107细菌加入 1 ml
2、 TROzlo 试剂。2、 将上述样品于15-30C静置5min，使核蛋白充分解离。3、加入0.2ml （1 ml TROzlo试剂）氯仿，盖紧盖子，充分 剧烈振荡15s并于15-30 C静置2-3min。4、 于2-8C 12000g离心15min。离心后样品分层，上层水相中含 RNA下层有机相中含蛋白和DNA5、取上清，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，于15-30 C静置10mi n后，在管底会出现胶状 沉淀，即为RNA。6、于2-8 C 12000g离心10min后弃去上清。7、向沉淀中 加入 1ml 75%乙醇，轻轻混匀。8、于 2-8C 7500g 离心 5min 后弃上清9、 将R
3、NA羊品凉干（不要彻底干燥），加入适量DEPC水溶解（可于55-60 C促溶10min ）。三、注意问题1、 在加入氯仿之前（第 1步），样品能于-60- -70 C保存至少一个月。2、 RNA沉淀（第6步）在75%乙醇中于2-8C能保存至少一周，于 -5-20 C能保存至少一年。四、RNA 定量RNA （ mg/mL ） =40 X OD260X 稀释倍数（n） /1000RNA 纯品 OD260/OD280=2.0五、RNA 电泳（1） 用 1XTAE 电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1XTAE 电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。（2） 在超净工作台上，用移液器吸取总 RNA样品4卩1于封口膜上。在实验台上再加入 5卩l 1 X TA电泳缓冲液及1卩I的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。（3） 打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min.用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察 RNA 电泳结果。