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1、免疫荧光操作步骤（漂片，冰冻切片）免疫组化步骤：1. 将脑片放到， 6 孔板（或 12 孔板），按照二抗说明书，加 3%双氧水封闭 10min （如果是从切片保护液取出，则要用 PBS洗一遍）；（二抗不同，操作步 骤有差别），本实验室使用的二抗试剂盒为中杉金桥超敏二步法试剂盒；2吸去双氧水，PBS洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意 不要碰到脑片；3. 然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入稀释后的一抗，一般，大 鼠脑片一张需 50微升一抗稀释液，小鼠脑片为 30微升；注意不要让液体流到 边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4然后，4C,过夜（18h或者
2、24h），不建议使用37C;5然后，PBS洗净两遍；剩下步骤见二抗试剂盒说明书。6. DAB配方为：lOmgDAB固体加到20ml0.01MPBS临用时加100-200微升 30%双氧水，注意避光。7. 显色 1 0 m i n ，看片子染色深浅情况适当调整显色时间。一般 3 分钟显色就 比较明显，如果 20分钟仍未显色，则看下面的参考。8然后PBS洗两遍，转移到载玻片，自然晾干。干燥天气 2-3h，潮湿天气3-4h。9. 脱水： 70%酒精 3min， 95%酒精 3min， 100%酒精 3min， 100%酒精 2min，二甲苯2min,二甲苯3-5min。如果片子上盐分较多，在 70%
3、酒精前在双 蒸水 1min。免疫荧光步骤及注意事项：1, 将脑片放到6空板的山羊血清封闭液中，封闭 20-40min;（如果是从切 片保护液取出，则要用PBS洗一遍）2,吸去山羊血清，PBS洗两遍，将脑片周 围的水用吸水纸或卫生纸擦净,注意不要碰到脑片； 3,然后按照一抗说明书,将一抗按比例稀释，加入 PBS稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需 50微升一 抗稀释液，小鼠脑片为 30微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要 重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体； 4, 4C,过夜（18h或者24h）,不 建议使用37C，如果荧光亮度不强，可以延长孵育时间到 48或72小时；5,然 后，PB
4、S洗净两一一三遍，按照二抗说明书稀释的荧光二抗，室温孵育 2小时。 注意避光操作。6, 0.01MPBS洗两遍，转移到载玻片上，避光自然晾干；7，滴加防淬灭剂后，盖上盖玻片镜下观察。常见问题：1，荧光太暗：可能蛋白表达少；可能一抗孵育时间短；二抗孵育时间短； 清洗次数过多；溶液 pH 不合适；荧光萃灭；一抗浓度过低或过高；二抗浓度过 低或过高；激发波长不在抗体适用波段。2，背景荧光太深：一抗浓度过高，清洗不彻底；二抗浓度过高，清洗不彻 底；封闭时间过短，非特异性过强；一抗非特异性过强；二抗非特异性过强； 显微镜荧光强度过强。总之实验是喜欢强阳性，不喜欢假阴性，呵呵。任何实 验都需要花时间摸索才
5、能找到其最佳的工作条件。另附免疫组化常见问题解析。原理是相同的，只是最后的显色方法不一 样，有些问题有启发作用。免疫组织化学1. 边缘效应 ? 原因:1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨 酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于 4微米，组织的前期处理应规范，尽量 避免选用坏死较多的组织。2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较 中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘 2mm。用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。2. 产生组
6、织切片非特异性染色的原因有哪些？如何解决？1. 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。解决办法:这可通过缩短一抗 /二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。2. 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。3. 内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的 组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；4. 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭 时间和适当增加浓度来加强封闭效果；5. DAB孵育时间过长或浓度过高；6. PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；7
7、. 标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。3. 免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些？后进行统计分析即可。3.评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（03分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（14分为 025%、2650%、 5175%、 76100%），最终可以分数相加，再进行比较。对于以上这 几种方法，各有利弊，请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着色 均匀、背景很浅的高质量切片。12.DAB呈色后到底什么样染色是特异性染色？阳性标记可以从色度特征，阳性标记细胞学特征来进行基本的判断。色度 特征：一般而言，抗原含量越多，分布密度越高，标记
8、方法越敏感，阳性结果 显色则越强。根据阳性标记的显色程度分为：淡黄色，提示为弱抗原；棕黄 色，提示为中等度抗原；棕黑色，示为强抗原。在结果判断中，后两者较有意 义，可作为判断依据。细胞学特征：阳性表达必须在细胞特定的抗原部位，若 不在抗原所在部位的阳性表达即使阳性也不应作为判断依据。一般分为胞膜 型，胞核型，胞质型，微绒毛型 ,复合型几种。这是需要结合背景知识的。同样，非特异性染色也有一定的特点：它首先是指抗原无明确定位，各种 细胞累及一片，色度无深浅之分，这种标记组织片不能作为免疫组织标记结果 判断的依据，造成非选民性染色的原因常为组织标本固定不佳，抗体质量问题 或稀释度不合理及操作方法不规
9、范等。因此，免疫组化特异性染色定位非常重 要，一般情况下，阳性细胞与阴性细胞相互交杂，阳性染色强度深浅不一。如 果缺乏细胞音的不均一性染色，即或呈阳性染色，常提示为非特异性染色。另外，组织片边缘反应和出血坏死灶周围阳笥反应不能作为诊断依据。13.1.石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？我用组织芯片和普通切片在多 种条件下进行了抗原修复实验，发现在热修复后，组织脱片最主要原因是组织 脱水不良，肿瘤组织黏附性差在小块组织时也容易撕脱（减小热修复加热功 率，PBS中洗时不要直对组织冲洗、可以有效防范）。2. DAB 显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？这 就是免疫组化染色的阴阳脸
10、，免疫组化实验是环环相扣的实验，任何一步试剂 孵育不全（没有均匀的在组织上孵育）都可能导致这样的结果。3. 免疫组化结果老是出现阴性结果？那就要考虑真阴性还是假阴性！假阴性 是你操作不当或者试剂质量的问题了。4. 切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？你的抗体是否特 异，孵育时间温度浓度是否过长！5. 一抗从 4 度拿出后，为什么有人说要 37 度复温，目的是什么？我没遇到 这样的说法，是否是想加速复温？还有我不知道国内的院校为什么对 37C孵育如此感兴趣，在你们买国外抗体时，他们的说明书上除了酶修复要37C外，其他步骤中均没有说要在37C中孵育。6. 免疫组化中抗原修复的最佳条件
11、是什么？尤其微波修复。抗原修复没有什 么最佳条件只有可能管用的修复条件。7. 有人在一抗孵育前用 tritonX100 来通透细胞，对石蜡切片需要否？ tritonX100 是脂质溶解剂，做免疫细胞化学时细胞膜是完整的半透膜，孵育的抗 体要自由的通过细胞膜就要用 tritonX100 来破膜。石蜡切片细胞多数是切开状 态了。但是脂质有时会吸附抗体，含脂质高的组织也可以用 triton 。8. 苏木素复染的时间应该是多少？复染过度咋办？要看你是用什么苏木素， 免疫组化复染，不比我们平常的 HE,它只要一般的轻微染色就够了，染过了就 凑合着看，或者试试 1盐酸酒精。9抗原修复应在灭活POD之前还是之后？看过国外文献说是要在抗原修复 之前修复内源性过氧化物酶，还用 CD3来说事，当初刚到病理科也傻乎乎的进 行验证了,没有发现老外所说的情况,写信质问,可能是他看不懂我的英文, 没回复。10. DAB显色时间到底多少为最佳？ 一定要是 310分钟吗？最佳显色时间应 该镜下观察,但是平时片子太多没法一一看过,就大致订个时间。11. DAB呈色后到底什么样染色是特异性染色？这是到如何阅片的内容，不 是三言两语可以说清的。熟能生巧,边学习边练习边思考方能学好。