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1、地黄连作障碍机理及其控制技术1 .地黄连作障碍1.1 地黄的药用价值及连作障碍现状地黄（Rehma nnia glut in osa Libosch为玄参科药用草本植物，广泛种植于河南、山 西、山东、安徽、吉林等地。地黄的药用价值早在我国最早的药学专著神农本草经中就有记述，现代研究认为地黄具有降血糖、保肝、止血、利尿、抗炎、抗真菌等作用。 其块根及其加工品分别作为鲜地黄、生地黄和熟地黄入药，属大宗常用中药材（温学森等2002）。目前有近1/4的中成药中含有地黄，其中包括广为人知的“六味地黄 丸，这些药物的生产与销售给我国一些制药企业带来非常可观的经济效益，仅“六味地 黄 丸”全国就有250多家
2、企业在生产，年销售总额达到40亿人民币（张中朋2005）。地黄忌连作，这已是几百年来公认的事实。早在十六世纪明朝卢之颐的本草乘雅半 偈中就提到地黄连作“种植之后，其土便苦，次年止可种牛漆。再二年，可种山药。足 十年，土味转甜，始可复种地黄，否则味苦形瘦，不堪入药也”。该问题至 今依然存在， 如果连作会导致出苗及生长等方面的问题，如出苗率低、植株弱小，须 根增多，不能正常 膨大形成具有商品价值的块茎等，严重时导致80%的减产（刘红彦等2006） o由于受到连作障碍的严重威胁，地黄产区不得不逐年易地种植地黄，使得其 栽培 地越来越远离其最适宜种植地区，质量也因此而受到影响（刘长河等2001）。1.
3、2 地黄连作障碍机理的研究现状及存在问题连作障碍普遍存在于小麦、大豆等粮食作物，烟草、棉花和花生等经济作物，辣 椒和 黄瓜等蔬菜以及占栽培品种60%的根类药用植物如人参、三七、地黄、丹参、贝母、桔梗 等（吴连举等2008;赵真真等2008）。虽然对连作障碍已进行过多方面的研究，但都未从 根本上揭示连作障碍的产生机制，对连作障碍机理的研究，依然是现代农业可持续发展的 热点课题之一。目前国内外对导致植物连作障碍的原因普遍认为主要有三个方面：土壤营养元素失衡和理化性质改变（马云华和魏琅2004）。同一种作物长期连作，必然造成土壤中 一些元素的亏缺和土壤理化性质如颗粒结构、pH值等的改变，进而影响下茬
4、作物的正常生 长，引起植株的抗逆能力下降，病害发生严重。土壤微生态失调（BenizrietaL2005；王学翠等2007；喻景权和杜尧舜2000）和病原微生物数量的增加（Bacaetal. 2003；解红娥等2007）。长期连作同一作物将改变土壤中微生物的种群结构和数量，有 益细 菌（plant growth promoting rhizobacteria, PGPR 减少，而有害根际细菌(deleterious rhizobacteria, DRB或病原真菌数量增加(Bacaet al.2003；王金龙2000；吴连举等 2008),从而影响植物正常生长甚至发病死亡。化感作用或自毒作用(Yu
5、 et al. 2003;张晓玲等2007)。化感作用是指一种植物或微生物(供体)向环境释放某些化学物质(化感物质或化 感效应分子)从而影响自身和其他有机体(受体)的生长和发育的化学生态学现象(Rice 1984o有的化感物质进入土壤会对同茬或下茬植物的生长产生抑制作用(Singh etal. 1999),当供体与受体属于同一物种时，就称这种抑制作用为自毒作用，而当属于不同 的物种时则称为他感作用。地黄是连作障碍最严重的植物之一，但关于地黄连作障碍机理的研究报道却非常 有 限。刘红彦等(2006)认为地黄根系分泌物、地黄叶和块茎中的化感物质是造成地黄连作障 碍的主要原因(自毒作用)，其中以根系
6、分泌物的化感作用最突出，但未确定化感物质是什 么。郝群辉等(2007)对怀地黄根际土壤水提物的GC-MS分析鉴定了一些已报道的化感物 质，也未指出哪些化感物质会抑制地黄生长。因此，关于影响地黄生长 的化感物质的种 类、来源、作用方式及其在土壤中的维持时间等至今还不清楚，现有 研究结果也很难解释 地黄栽培1年须间隔810年方可再种植的连作障碍现象。陈慧(2007)和刘峰等(2007)认为根际微生态失调可能是地黄连作障碍的因素之一。其 依据是土壤中不同细菌对地黄成分水苏糖和梓醇的利用能力存在差异，推测利用地黄成分能力强的细菌随着地黄连作而成为优势种群，而利用能力差的细菌种群数量将逐渐 受到抑制。但
7、地黄根际存在的“优势菌”是什么？是否存在对地黄有害的细菌？这些有害 细菌对地黄生长有何影响以及这种影响与连作障碍之间有何关系等问题至今还都是谜。刘伟(1990)和杨胜亚等(2002)用农药浸种的方法使地黄种苗的出苗率及成活率提高； 刘红彦等(2006)对重茬土壤进行灭菌处理，发现灭菌处理后的地黄重茬土壤上栽培的地黄 块茎产量显著高于未灭菌的对照；本课题组在07-08年也比较了高压蒸汽灭菌处理前后地黄连作土壤室内栽培地黄的效果，发现经灭菌处理后的地黄连作土壤上 栽培 的地黄生长良好，而未灭菌处理的地黄连作土壤上栽培的地黄却表现出出苗率下降、幼苗 长势差的现象(图1)。由这些实验可以推论，连作土壤
8、中存在着对地黄有害的微生物，且 这些有害微生物可能与地黄连作障碍有关，抑制这些有害微生物有可能对克服地黄连作障 碍有效。然而，截止目前，还没有人系统调查过地黄根际存在的对地 黄有害的微生物种类 及数量分布，更无人研究过它们与地黄栽培、地黄连作障碍发生 之间的关系。总之，关于地黄连作障碍的发生机制，尚有许多未解之谜，已有研究结果很难完全解 释清楚地黄连作障碍危害严重、持续时间长的特殊现象。因此，有必要进一步寻找引起地 黄连作障碍的因子，并了解其影响机理。1.3 地黄连作障碍的控制2 .研究结果2.1 地黄连作障碍的原因本课题组从2007年开始，和北京中龙创科技有限公司委托，研究地黄连作障碍的形
9、成机理及防治技术，已从连作12年的地黄根际土壤和块根表面分离到19株细菌，采用 盆栽接种土壤法和地黄植株叶片涂抹法，分别检测了这些细菌本身及其无菌培养液（培养 液滤液）对地黄块根出苗以及地黄叶片的影响，主要结果及结论有如下几点：有2株细菌的培养液滤液对地黄出苗有抑制作用（15天），并对叶片有毒害作用（24h），而直接接种细菌细胞处理对地黄块根出苗以及叶片无任何影响（图2）,说明这类细主要是通过分泌化感效应分子影响地黄生长是典型的化感细菌;经形态学、生理生化反应以及16SrDNA序列分析，将这两株化感细菌鉴定并分别命名为Pseudomonassp. DH9 简称：DH9）和 Enterobact
10、er sp. DH13 简称：DH13）。用DH发酵液滤液浸种地黄块根与将DH9g酵液滤液直接灌入地黄栽培土壤两种 处理的结果不同，前者（使用量较小）与空白对照相比幼苗生长势差，后者（使用量大） 却不出苗、块根坏死（图3）；反映了发酵液滤液使用量大小和对地黄影响程度之间可能 存在量效关系。刨出中各组地黄的块根，发现空白对照块根下面已生出新根，而发酵液滤液浸 种地黄块根及灌土均无新根萌发（图4），说明发酵液滤液中的化感效应分子除了影响地 黄出苗和幼苗生长外还影响地黄块根生根。向DH9液体培养基中添加不同量的地黄块根汁液，可使DH9和DH13生长速度提 高13倍（图5）,说明地黄成分能够促进化感细
11、菌的分裂增殖。在活性检测指导下初步分离了 DH9发酵液滤液中的化感效应分子，该效应分子 可 经大孔树脂吸附、甲醇洗脱、硅胶柱和Sephadex LH-204行初步分离纯化，所得活 性组 分用GC-M鲂析未发现已报道的化感物质。另外，用此咤联苯胺比色法测定活性 组分，也 未检测出含氟化合物，表明DH9产生的化感效应分子可能是未知的化感分子。基于前人的研究成果和本实验室获得的初步结果，我们推测，根际化感细菌可能与地 黄连作障碍有关，甚至化感细菌在土壤中长期存在并分泌化感效应分子可能是导致地黄连 作障碍时间长（种植1茬后须间隔&10年才能再次种植）的主要原因。化感细菌与地黄 连作障碍的关系可能是：化
12、感细菌是一种土壤常在菌，栽培地黄促进土壤中该类细菌生 长，使其成为优势种群；化感细菌反过来通过分泌化感效应分子抑制地 黄生长，地黄连作 将导致其影响进一步加重；由于化感细菌可长期存活于土壤中，使得地黄种植一茬后很长时间不能再种植。这一假说整合并丰富了目前关于地黄连作障碍的微生态失调理论与化感作用理论，将为探讨地黄连作障碍的特殊之处提供新的途 径。2.2 地黄连作障碍的防治根据地黄连作障碍的化感细菌侵染假说，我们于 2010年4月11 口在山西临汾洪洞 县淹底乡杨岳村安排了不同药物防治的区组实验，包括抗生素处理组、拮抗菌菌液处 理 组、菌肥处理组、抗生素与菌肥联合处理组，以多菌灵阳性对照组和水为
13、阴性对照 组。实 验设计见表1。除了菌肥处理组采用沟施外，其它处理均为浸种30min,每处理 播种块根 60个，种子于播种前1天从种子地中挖出，地块为种植一年（连作1年）的300平方米地 黄土地（种植地黄前施5立方米左右羊粪基肥）。重复3次。调查数据进行One-way ANO VA分析，其中百分数均进行反正弦转换。2.2.1 不同抗生素对地黄连作障碍的防治效果除多菌灵处理的植物数显著低于空白对照外，三种抗生素及其组合处理对地黄植物数 和块根数没有显著差异，表明抗生素处理不影响地黄植株的生长。（1）对地黄生长的影响KSTh2.2.2 不同菌液对地黄连作障碍的防治效果（1）对地黄生长的影响5 0-
14、|40.)秒数株CX120CX130CX185LCH0606CX120-1300X185.0606 CarbendazimH2O(2)对地黄土壤细菌种群数量的影响采用DAP染色后的显微观察技术，调查了不同微生物制剂浸种处理后土壤细菌种群数 量 的差异，结果显示CX12c与CX09浸种处理较阳性与阴性对照均显著提高，而 CX130 与CX185浸种处理与对照未到达显著性差异。一方面地黄成分对CX12 (与CX09!株的生 长可能有促进作用，导致根际细菌种群数量显著增加，另一方面，CX120与CX0S菌株的加入，有改善土壤理化性质的功能，促进土壤中其他细菌种群数量的增加烫 p数茵母2.2.3 不同菌肥的防治效果(1)对地黄生长的影响ab3Da(2)对土壤细菌种群数量的影响DAP染色显微观察结果显示除CX120勾施处理显著高于阳性与阴性对照，而其他处理 均 未与对照到达显著性差异。沟施CX12(地黄土壤中细菌种群数量的增加是由于自身 生长较 快所致还是因其改变土壤的微生态平衡而引起其他细菌种群数量的增加，值得探讨。2.2.4不同抗生素与菌肥组合的防治效果(1)对地黄生长的影响50.TT-CX13(W)ST-CXiatO6KCX13M6KCX185.O6S-CX130.MSCX1fl6-06KST-13MGhKST-13OO6hKST.13Q.Da09 aiaiae工uasoeiH2O