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1、生物工程学报Chinese Journal of Biotechnology20卷3期2004年5月Vol. 20No. 3Mav 2004Zif268的锌指DNA结合区在大肠杆菌中的功能性表达赵志虎收稿 11 期:2003-09-10.修阿 I I 期:2OO4-O2-12。基金项II :国家门然科学基金资助（No. 39970162），国家高技术研究发展计划（863）$项基金资助（Nu. 2（X）2 AA227022）。 通讯作者. Tel: 86-10-66931809: Fax: 86-10.68215721: E-mail： ziiaozlinic.bmi.ac.ti中匡科写宪级生吻
2、研究祈期刊联合:尸部bttp: journals i ac cn胥全彬马清钧（军事医学科学院生物1程研究所，北京IOO85O）摘要锌指蛋白是垠人的蛋白家族，是识别核酸加常见的、垠有效的结构元件。通过选择介适的农达载体及诱 导衣达条件，实现了小鼠转录因子Zif268的锌指DNA结介区在人肠杆菌屮的部分可溶性衣达。凝胶迁移率移动试 验证实纯化的可溶部分锌指DNA结介区可以特异性识别、结介其人然靶序列，提示锌指DNA结合区在人肠杆菌屮 得到了功能性表达。锌in DNA结介区在人肠杆菌中的功能性农达成功为锌指蛋CI-DNA相互作用的胞内遗传筛选 模型的建立奠定了基础。关键词 锌指蛋白，可溶性农达，凝胶
3、迁移率移动试验中图分类号 Q78文献标识码 A文章编号1000 3061（2001）03 0352 01生物工程学报Chinese Journal of Biotechnology20卷3期2004年5月Vol. 20No. 3Mav 2004生物工程学报Chinese Journal of Biotechnology20卷3期2004年5月Vol. 20No. 3Mav 2004锌指结构是一种长约30个氨基酸的瑕常见的 核酸识别皋序，整个肽段通过锌离子与半胱氨酸和/ 或组氨酸的螯合配位形成一种稳定的“指头”样高级 结构。H 1985年在非洲爪蟾转录I大1子TFIIIA中发 现第一个锌指以来，
4、冃前已在20500多种蛋白中 发现67000多种不同的锌指序列，成为所有DNA结 介蛋白中最庞大的一个家族，事实上也是最大的 蛋白家族，这表明锌指结构在进化上是识别核酸最 常见、最成功的一种结构模式，因此成为研究蛋白. 核酸特别是蛋白DNA相互作用的理想材料。锌 指蛋白DNA相互作用的研究，对丁蛋白一DNA识 别规律的揭示、序列特异性DNA结合蛋白的设计与 筛选以及特定基因表达调控的人为干预等具有車要 意义。早期的经典方法如Dnase I足迹法、甲皋化保护 实验等，对于锌指DNA的相互作用的研究起到了重 要作用2一&,但以上这些实验都是体外实验，很难真 实地反应体内锌指一DNA相互作用规律。鉴
5、于此, 我们拟以小鼠转录因子ZI126814为材料，首先实现 其锌指DNA结介区在大肠杆菌中的克隆与功能性 农达,进而建立一种研究锌指蛋白DNA相互作用的 体内遗传筛选模型。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株与质粒:大肠杆菌DH5aMCR、JM109:质 粒pUC18 pGEX2T木室保存，r）BKS-Zif268来源于 ATCCo1.1.2 试剂：EcoR 1 BamH 1、T4 DNA 连接酶、Taq DNA聚介酚、Mi DNA聚介酶、蛋白分子量标准、核 酸分子量标准、PTC、（1NTP、X-gal、Bulk & RediPack GST Purification Modules 等为
6、Promage Biolab Phaniar- cial等公司产品。1.1.3培养基:锌指蛋白表达需用专用培养基I.B Zif,其组成为在LB的基础上添加100mmol/L ZnCl2, 100pg/mL J酪氨酸,20mmol/L 的 HEPES（用 NaOH 调 |）U 7.0 ）以及不同浓度的IPTG,氨节青焉素100 /ig/mLo1.2方法1.2.1常规分子克隆技术：根据文献7以及New England Biolal） Promega等公司产ui说明书进彳丁。1.2.2锌指DNA结合区的PCR扩增：根据锌指 DNA结合区在棉个Zif268蛋白中的位置及其序 列叫设计如下两条的引物,两
7、端分别添加EcoW 1 .切位点，3端引物的末尾添加终止密码3期赵志虎等:Zif268的锌指DNA结介区在大肠杆繭中的功能性表达355TGATAAoPhx： 5Z - AAGGATCCGAACGCCCATATGCTrC-? 对应 J ; DN A 结合区的氨基端片工:5ACGGAATTGTATCAGTCC1TCIT；TCTEAATGG3 对 应于DNA结合区的拔基端PCR按照如下条件进行：在10(加L反应体系中 顺序加入去离子水、二甲亚fM DMSO、聚合酶缓冲 液、4种脱氧核昔酸混合物4xdNTP、模板、引物、 DNA聚介酶，使引物终浓度为lpmol/MLdNTP的终 浓度为 0.2imio
8、l/L, DMSO 浓度为 2% 3%( V/V )。 整个操作过程在冰浴条件下进行，并采用热启动 PCR程序。1.2.3 DNA序列分析：由上海博亚生物公司完成。 1.2.4菌体的诱导表达:挑选单克隆接种5mL LB Zif培养基(Ap 100/创皿),37弋振摇(250 r/min)培养 过夜，按2 %的比例取过夜培养物接种于摇瓶，相同 条件继续振摇培养2 引】,培养物0值为0.3 0.5时，加入不同浓度的IPTG, 25 30%：振摇诱导培 养(250 r/niin)4 6h,离心收获菌体。SDS-PACE 分 析蛋白表达情况。1.2.5蛋白的纯化:谷胱II肽转移酶GST融介蛋口 的纯化
9、采用 Plianiarcial 公司的 Bulk & RediPack GST Piirification Modules并参照其产品说明进行。主要分 为谷胱甘肽SepharoseCL 4B的准备、样品的制备、结 合与洗脱、酶切与分离等步骤。1.2.6凝胶迁移率移动试验：(1) 双链DNA探针的制备：采用Klenow大片段 DNA聚介酶补平法。在10卩L反应体系中，取Zif268 的结介位点的两条互补链以及随机互补核苻酸片段 各lOpmob 10 x退火缓冲液1吐,95煮沸5min，缓 慢降至65迟，维持lh，再降至室温。向退火混合物 中加入 2mL DTT(20nuiK)l/L)35ML d
10、NTP5ML 10 x 随 机标记缓冲液(100mmol/L MgCl2, 900nunol/L HEPES，pH 6.6)、5”L a-32P(1ATP 以及 3u 的 Klenow 大片段聚介酶，室温反应3 12h，得到标记好的探 针，-20七保存备用。根据文献，介成的含有 Zif268保守结介位点的两条互补寡核苻酸链片段的 序列如下，其中阴影部分为ZI1268的结介位点。ZB1： 5* AA1TC :VTCCCTCCCCCC CTCCACC 3ZB2： 3ZG TACGCACCCGCC GACGTCCATGC-5Z(2) 结介反应：在结介缓冲液(1 Onu)K)l/L Tris-Cl p
11、H 7.5 IOOdmhoI/L KC1 luunol/L MgCL luunol/L DTT，0. lnunol/L ZnCI2 10% Glycerol* 0.05% BSA占J4% FicolMOO)中加入0.2mnol标记好的双链探针,5/zg/uL的鮭血椿DNA以及不同浓度的蛋白，室温保 持15mhb取10“L样品进行12%非变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳(150Vx 1.5H),电泳完毕,放射自显影。2结果2.1 ZU268锌指DNA结合区的PCR扩增及克隆 以质粒pBKS-Zi(268为模板，以、为引物, 在53卜退火扩增得到含有Zif268锌指DNA结合 区的片段D(图l)obp15
12、34 994 695 515 377 237 MD图1 Zif268锌指DNA结介区片段1)的PCK扩增Fig. 1 Thu PCR of fragment D containing Zinc fingers DNAbinding domain of Zii268PCR扩增产物经Pmmega公司WizanT PCR Preps试剂盒纯化、BamU 1、EcoR 1酶切后，与用同 样限制酚处理的pUC-18连接。连接产物转化大肠 杆菌DH5aMCR,挑収单克隆。经人小、酶切鉴定及 圧列测定，得到全序列正确的克隆pUC-Do2.2 Zif268锌指DNA结合区在大肠杆菌中的表达用HamH 1、Ec
13、oR 1酶切质粒pUCI),冋收冃的 片段,插入到pGEX2T,进行表达质粒的构建。表达 质粒经大小、齣切鉴定，得到正确克隆pGEX-D(图 2)oM pGEX-Dbp534mi994 VW695 515 377237图2衣达质粒的双酶切鉴定(&皿1+弘川1)Eig.2 Tlie ivstnction analysis of expressionplasmids ( fit oK 1 + Bam 11 I)中世科亍反.攵生呀硏究汕WlfiJ取台尸耶 Hp journals i ac cn表达质粒p（；EXl）转化大肠杆菌JM109,挑取单 克隆，过夜培养,2%稀释接种，以40/wiol儿IPT
14、（；诱 导,诱导后在25 30尤下继续培养3 4h,进行蛋白 的表达，结果（图3）发现:锌指DNA结介区得到了表 达，在大小为34.Old）的地方出现LI的条带，此外，在 超声破菌上清中含有明显的融合蛋白，这表明在所 选择培养条件下，锌指蛋白DNA结A区在胞内得到 了部分可溶性表达。2.3融合蛋白的纯化离心收集培养菌体，超声破菌，离心分离禽有H 的蛋白的上清，与准备好的谷胱甘肽Sephaiwe 4B混 合，使冃的蛋白与之结合。结合混合物一部分用含 有谷胱11.肽的洗脱液洗脱，得到融介蛋白，另一部分 用凝血酶切割，再行洗脱分离，分别得到谷胱廿肽转 移閒及锌指DNA结介区，纯化結果见图3。从图中
15、可以看到：利用亲和层析可以得到特异的融合蛋白 GST-D, Iflj且融合蛋白在凝血酚的作用下，可在融A 位点处特异地被切割，得到游离的日的蛋白Do图3蛋门纯化产物的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE analysis of purified product1 9die puriGdl D, GST GST-D the su|M*nkatanl*|M4let and total pnrteiiis （if JM 1（）9（ j）（；EX-D lysate with IPT（； induction* the total prol&ns of JM109（ pGEX-D）without
16、IPTG inducliutit the proteins of JM109（ |）GEX-2T）with ainl williout 【PTC； iixiuctioiP rejijMMlively.2.4 Zif268锌指DNA结合区的DNA结合活性分 析虽然DNA结介区与谷胱卄肽转移酶融介，在大 肠杆菌中获得了稳定的、部分可溶性衣达，但所得锌 指融介蛋白是否仍保持其DNA结介活性？为此，本 研究又通过DNA结合凝胶迁移率移动试验，对其体 外的结合特性进行了分析。结果（图4）表明：无论是融合蛋白GST-1）,还是单独的锌指DNA结合区I）,都保持了与特定靶位点 DNA结介的特性,这与文献报道
17、GST与真核转录因 子融介衣达，通常并不影响转录因子的DNA的结介 活性相一致。123456789123456789B*-FIi “图4纯化蛋门的凝胶迁移率移动试验Fig.4 The gel mobility shift assay for purified GST-D and D! I! illustnite Hw bindingof pnHein （JST-D* D.B irniicate the free, bound pnW 1 9 pnetit 0. 4 8- 16, 32, 64, 128, 256, iumI 512niiK）l/L pniteiiH respeclivily虽然
18、体外结合活性不能完全反映体内情况,但 是由尸我们在融介蛋白的格个纯化制备过程中，始 终保持着较为温和的条件,更为匝要的是，我们并没 冇对目的蛋白进行复性等步骤，因此体外的凝胶迁 移滯留实验,与其在胞内的DNA结介活性，应具有 很好的相关性，而体内遗传模型的最终成功建立， 更頁接验证在我们设定的培养条件下，锌指蛋白的 1）NA结合区确实在人肠杆菌小得到了功能性表达。3讨论外源妹因在大肠杆曲屮的表达受多种因素影 响101，而锌指蛋白在大肠杆菌中的严格可调控、稳 定、功能性表达，对于体内遗传筛选模型的建芷乂非 常重要。因此,在载体的选择及蛋白的表达上进行 了一些尝试。木研究起初试图在大肠杆菌中实现游
19、 离锌指蛋白的表达，但未获成功，因此转而考虑融介 表达系统。谷胱卄肽转移酶GST融介表达系统具 有高效、易于纯化及调控严格等优点，非常适介外源 蛋白尤其是真核转录因子的功能性表达。此外, 由丁在本设计的最后遗传筛选试验中，需要粋农达 质粒、报导质粒转到同一大肠杆菌宿主中，因此还必 须考虑两个质粒的相容性以及对宿主的要求，由J- GST融合农达载体pGEX-2T本身倉有lacF垄因，对 宿主没有任何要求。M J* PGEX-2T的以上优点，我 们选择它來进行锌指蛋白在人肠杆菌中的功能性衣 达。本实验中，通过特定培养基、培养条件（低温、低 浓度IPT（；的诱导）、特定融介伴侣等的选择，实现了 辞指
20、蛋白l）NA绻合总在人肠杆菌屮的部分可溶性 表达，而该蛋白未经复性条件下，在体外即可以与特 定靶位点DNA特异性的结介，这初步表明，其在胞 内很可能是具有功能性即保持DNA结合特性的。 随后体内遗传筛选模型的建立以及识别天然靶序列 锌指突变体的获得山，进一步表明在大肠杆菌中 可溶衣达的ZII268锌指DNA结合区确实保持了其 特定的I）N A识别、结合特性，具有特定的生物学活 性。此外，研究结果还衣明，在体外游离的锌指蛋白 DN A结合区在随着高浓度而出现两条信号（图5 II 的泳道8、9）,这表明高浓度的游离锌指蛋白DNA结 件区可能相互作用形成了二聚体。最近,Yusufzai等 人在研究锌
21、指蛋白CTCF时，发现其在体内也能形 成二聚体其至三聚体。最近，本研究小组还利用硫氧还蛋白的翻译耦 联系统实现了虹独锌拆DNA结介区在大肠杆菌中 的完全可溶性表达单独或融合形式锌指结合 区在大肠杆菌中的功能性表达，为锌指蛋白DNA相 互作用的体内遗传筛选模型的建立，奠定了基础。 瑕近发现，锌指蛋白除了可以识别DNA、RNA、DNA/ RNA杂交双链并与Z相互作用外，还可以介导蛋白. 蛋白相互作用，I大1此本实验还将对锌指蛋白核酸/ 蛋白相互作用的研究提供便利。REFERENCESC参考文献）1 1 Miller J* M la-hhin AD KlugA. RejMHive zinc-bind
22、ing lvnains in the protein transcripion factor III A hum xenojms oocytes. EMH（）、 1985. 4li（M）（actors as glutathioiie-S-lraiisferase fusions in E coli. Methods Mol Bi儿 1994- 30: 185 - 1979 Zhao ZH（赵志虎），Ma QJ（马消钧）.Development ami application of an in vivo genetic selectionthe ennutation study for 1）、A
23、nx*）gnizing s（x?cificity of zinc-finger protein Chimi Patent: CN 1438323A（中国专知）r 101 I lockney HC Itm dcvelopnwnts in liti（le withDNA rec-ognition prqxrty in Esdierichia a di Cliinese J（Airnal jf Hivleduivlog）（生物匚程学报）,2001,17（4）:406 - 40912 Yusufzai TM. Tagami H Nakatiini Y. Fels which indicates the
24、 DNA binding domain lvniains its DNA binding activity in Escherichia coli. The lime tional expression of DNA binding doiiKiiii of Zif268 will greatly facilitate the developmenl of in vivo grnelic selection assay for the study of Zinc fingersl）NA inteniction.Key words Zinc-finger pivtein Soluble expr
25、ession Gel nubility shift assayReceived： 09-10-2003This work was su（）|M）rte（l by grants from the National Nalunil Science Fcnuulation of China（ No. 39970162） the National 1 Iigji-T:h Beveluj）nMfcnl Program （863）of China（ No. 2OO2AA227O22）Corresponding author Tel: 86-10-66931809: Eax： 86-10-68215721: E-niail： zliaozhnic. 的M科邸覽戏土呀緞P斤MlM奴合迟如部http: journals in ac cn