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1、分光光度法原理：光是一种电磁波，具有一定的波长和频率。可见光的波长范围在400- 760nm，紫 外光为200-400nm,红外光为760-5000nm。可见光因波长不同呈现不同颜色，这些 波长在一定范围内呈现不同颜色的光称单色光。利用棱镜可将白光分成按波长顺序排列的各种单色光，即红、橙、黄、绿、青、 蓝、紫等，这就是光谱。有色物质溶液可选择性地吸收一部分可见光 的能量而呈现不 同颜色，而某些无色物质能特征性地选择紫外光或红外光的能量。物质吸收由光源发出的某些波长的光可形成吸收光谱,由于物质的分子结构不同, 对光的吸收能力不同,因此每种物质都有特定的吸收光谱，而且在一定条件下其吸收程 度与该物
2、质的浓度成正比，分光光度法就是利用物质的这种 吸收特征对不同物质进行 定性或定量分析的方法。在比色分析中，有色物质溶液颜色的深度决定于入射光的强度、有色物质溶液的 浓度及液层的厚度。当一束单色光照射溶液时，入射光强度愈强，溶液浓度愈大，液层 厚度愈厚,溶液对光的吸收愈多，它们之间的关系，符合物质对光吸收的定量定律，即 朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律。这就是分光光度法用于物质定量分析的理论依据。朗伯-比尔定律：物理意义：当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，与其吸光度A与吸 光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比。数学表达式：A=lg(1/T)=KbcA吸光度；T透射比，是
3、透射光强度比上入射光强度;K为摩尔吸收系数，它与吸收物质的性质及入射光的波长人有关；C吸光物质的浓度；B吸收层厚度。使用方法：721可见分光光度计其波长范围360800nm，色散元件为三角棱形.1 .检查仪器各调节钮的起始位置是否正确，接通电源开关，打开样品室暗箱 盖，使电表指针处于“0位”，预热20min后，再选择须用的单色光波长和相应的 放大灵敏度档，用调“0电”位器调整电表为T=0%。2 .盖上样品室盖使光电管受光，推动试样架拉手，使参比溶液池（溶液装入4/ 5高度，置第一格）置于光路上，调节100%透射比调节器，使电表指针指T =100%。3重复进行打开样品室盖，调0,盖上样品室盖，调
4、T为100%的操作至仪器稳 定。4.盖上样品室盖，推动试样架拉手，使样品溶液池置于光路上，读出吸光度 值。读数后应立即打开样品室盖。5 .测量完毕，取出比色皿，洗净后倒置于滤纸上晾干。各旋钮置于原来位 置，电源 开关置于“关”，拔下电源插头。6 .放大器各档的灵敏度为：“I欢1倍；“ 2倍1;0 “ 3”x倍2,0灵敏度依次增大。由于单色光波长不同时，光能量不同，需选不同的灵敏度档。选择原则是在能使参比溶液调到T二 100%处时0尽量使用灵敏度较低的档0以提高仪器的稳定性。改变灵敏度档 后0应重 新调新和” “100。”注意事项：1、该仪器应放在干燥的房间内，使用时放置在坚固平稳的工作台上，室
5、内照明 不宜太强。热天时不能用电扇直接向仪器吹风，防止灯泡灯丝发亮不稳 定。2、使用本仪器前，使用者应该首先了解本仪器的结构和工作原理，以及各个操 纵旋钮之功能。在未按通电源之前，应该对仪器的安全性能进行检查，电源接线应牢 固，通电也要良好，各个调节旋钮的起始位置应该正确5然后再按通电源开关。测定方法：1 .选参比测定试样溶液的吸光度，需先用参比溶液调节透光度为100% （吸光度为0），以消除其它成分及吸光池和溶剂等对光的反射和吸收带来的测定误差。2 .选方法：单组分和多组分（1）单组分是指样品溶液中含有一种组分，或者是在混合物溶液中待测组分的 吸收峰与其他共有物质的吸收峰无重叠。有校准曲线法、标准对比法和吸收系数法 等。校准曲线法（常用）：配制一系列不同含量的标准溶液，选用适宜的参比，在相同的条件下，测定系列 标准溶液的吸光度，作A-c曲线，即标准曲线，也可用最小二乘数处理，得线性回 归方程。在相同条件下测定未知试样的吸光度，从标准曲线上就可以找到与之对应的未知 试样的浓度。 3/3