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1、利用单单杂交技术选育出平菇菌种 A0713摘 要：随着食用菌行业的发展， 利用生物技术手段培育 出优良平菇新品种逐步成为各国科学家研究的重点， 但因平菇品 种繁多，名称不统一，直观判断其优劣不够准确和科学，给深入 研究带来了很多不便。本试验利用模糊综合分析法初步研究了 17 种异源菌种的优劣，而后利用原生质技术中的单单杂交方法 对 2 种异源菌种进行了杂交，经过菌丝镜检、 A0713 与亲本拮抗 试验和 A0713 出菇试验初步证明融合成功。平菇是一种广为人知的食用菌资源， 其含有丰富的氨基酸和 人体必需的微量元素， 越来越受到人们青睐。 我国有着丰富的食 用菌资源，平菇 (Pleu-rotu
2、s ostreatus) 隶属于担子菌门、层菌 纲、伞菌目、白蘑科、侧耳属。平菇是一种白腐真菌，菌丝体为 白色的丝状体。 1 朵平菇其中含数亿孢子，平菇是四极性异宗结 合的品种，是由成熟子实体产生担孢子在适宜环境下长出芽管， 初期多核，芽管不断分枝伸长，形成单核菌丝。不同性别的单核 菌丝结合 ( 质配) 后形成双核菌丝。 双核菌丝主要特征是在隔膜上 有锁状联合。 在适宜条件下双核菌丝可以形成子实体。 平菇具有 生长迅速抗逆性强等优点，因而栽培广泛，随着食用菌行业的不断发展， 食用菌的营养和药用价值越来 越被人们所认知。 平菇作为一种常见的食用菌产品也备受人们喜 爱，其含有大量人体必需的氨基酸和
3、各种矿物质。 为了让食用菌 能够适应更多样的环境或者使其含有更丰富的营养， 选育新的平 菇菌种至关重要。本试验采用模糊综合分析法研究异源平菇菌 种，以便更加科学地判断菌种优劣， 为改良平菇菌种提供必要的 材料和理论依据。目前食用菌原生质体技术已成为食 （药）用菌生理、 生化、遗 传等基础理论研究和进行菌种改良的一种有效手段， 1957 年， Eddv等首次用蜗牛酶溶解酵母菌细胞壁，分离到原生质体。这 项技术应用到食用菌行业是在1973年，当时 Wessds和Devries分离得到了裂褶菌的原生质体。 利用原生质体培育新品种的技术 主要有：原生质体融合技术、原生质体诱变技术、单核和同核原 生质体
4、技术、 原生质体的转化等方法。 本试验是把初筛得出的拥 有良好性状的平菇进行单核融合， 然后利用有无锁状联合初步选 择出融合子， 通过出菇试验进行验证， 为平菇菌种的选育提供参 考。1 材料与方法1.1 供试材料1.1.1对 28 种平菇拮抗试验供试菌种： 平特大 8 号、大白平 1 号、 短平、苏引 6号、华平 49、华平 36、华平 97-2 、杂交 16、杂优 6 号、白平 5 号由华中农业大学提供； 109、平二号、皑雪、黑 平王、四季大白、 539、平一号、澳黑、 326 由哈尔滨食用菌研 究所提供； 00412、 801 、802、 00329、00410、优光 1 号、黑平菇 2
5、2 号由中国农业科学院植保研究所提供；平保1 、平保 2 由东北农业大学微生物实验室提供。培养基：PDA培养基（去皮马铃薯200g,葡萄糖20g,磷酸二氢钾1g,琼脂20g,蒸馏水1000mL）。1.1.1 对 17 种异源侧耳模糊综合评价供试菌种：澳黑、 平特大 8号、短平、苏引 6号、黑平王、华平 36、杂交 16、白平5 号、 109、平二号、皑雪、四季大白、 539、 326、 00412、 801 、 优光1号。培养基：PDA培养基（去皮马铃薯200g，葡萄糖20g， 磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL）；液体 PDA培养基（去皮马铃薯200g，葡萄糖20
6、g，磷酸二氢钾1g，硫 酸镁0.5g，蒸馏水1000mL）。1.1.2 利用单单杂交技术选育平菇供试菌种：选择综合指数比较好，而且蛋白和漆酶含量较高的 Y5号和Y1号菌株。培养 基：PDA培养基（去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾1g， 硫酸镁05g，琼脂20g，蒸馏水1000mL），pH值自然；液体再生 培养基（MB）:蛋白胨0.5g，酵母膏0.5g，甘露醇10g，葡萄糖 2g，MgS040.5g,蒸馏水 100mL，pH值 7.0。上述培养基均在1.21 x105Pa下湿热灭菌30min。配制 0.6mol?L-1MgS04， 0.6mol?L-1 甘露醇待用。溶壁酶：广东微生
7、物研究所研制，用前配制，0.22卩m微孔滤膜过滤。1.2 试验方法1.2.1 对 28种平菇拮抗试验 以选定菌株的粗蛋白含量、 漆酶活性、日均生长量、干物质质量为变量，采用模糊概率法更 科学地评价多个菌种生物特性的综合规律变化， 从而客观评价菌 株优劣。 此方法克服了用单一条件评价菌株优劣的局限， 王国印 将模糊概率应用于棉花品种综合评价，并取得良好结果。在 PDA 培养基试管上做拮抗试验。 每 2 种菌株为 1 组，把 2 个不同菌株 接到同1试管斜面上，2个接种点间距约4cm置于28C恒温培 养箱中培养， 当不同菌源菌丝生长边缘靠近时， 自正面观察其继 续生长情况，自反面观察色素沉着情况。
8、1.2.2 对 17 种异源侧耳模糊综合评价试验 以选定菌株 的粗蛋白含量、漆酶活性、日均生长速度、干物质质量为变量， 采用模糊概率法更科学地评价多个菌种生物特性的综合规律变 化，从而客观评价菌株的优劣。 此方法克服了用单一条件评价菌 株优劣的局限。将菌种接于固体PDA平板培养基上，以接种点为 中心在其萌发后第 2 天开始测每天的长速：在含玻璃碎片液体 PDA培养基里，用接种器接入半径3mm菌种块，于黑暗中静止4d 后进行摇床培养，培养条件为 25C, 220r.min-1，培养4d后按 10%接种量接人摇瓶培养基中，在温度 25C、转速220 r?min-1 的摇床中震荡培养5d,测干物质质
9、量、漆酶活性和粗蛋白含量。1.2.3 利用单单杂交技术选育平菇试验 由于 1973年 Wessels 和 Devries 在研究裂褶菌原生质体的制备和再生中，发 现再生菌丝体中存在双核、 单核 2 种。后来研究发现菌丝体在制 备原生质体时出现 3 种类型的原生质体， 即无核原生质体、 单核 原生质体和双核原生质体。 所以本试验采用利用原生质体再生的方法培育出菌丝。 然后挑出其中单核菌丝进行杂交， 通过杂交后 子代与亲本拮抗试验和出菇试验进一步证明融合是否成功。123.1 菌丝培养 在PDA液体菌种内加适量玻璃碎片灭菌后接入直径约6min菌种。先在黑暗25C条件下静止4d,然后 置于摇床培养5d
10、，吸取12mL菌悬液接到含20mL液体培养基 的150mL三角瓶中，在220r?min-1的摇床上培养 6d,温度25C。1.2.3.2 原生质体制备和再生 通过过滤获取培养好的幼嫩菌丝体200mg经无菌水清洗2遍和渗透压稳定剂洗涤2次，再用无菌水洗涤后吸去水分，按照菌丝（1mg）:酶液（8卩L）比率加1.5 %溶壁酶液，在28C下水浴6h,在酶解过程中进行 振荡，一般每 0.5h 左右 1 次，可使原生质体悬浮。将原生质体 悬浮液用灭完菌的脱脂棉柱过滤， 把残余菌丝体过滤除去， 然后 滤液经2000r?min-1、4C离心10min,取沉淀即为所需原生质体。 在原生质制备中每个条件都十分关键
11、， 直接影响到原生质体的释 放量，对于酶液浓度、酶解时间、稳渗剂浓度的合理配比研究也 十分重要 （ 另文发表 ） 。将得到的原生质体用渗透压稳定剂 （0.6m01丄-1甘露醇）悬浮稀释，涂布于再生培养基上25C培养， 20d 左右培养基上可出现微小再生菌落，挑取其菌落于斜面试管 中在25C下培养。1.2.3.3 单核菌丝体收集从再生培养基挑出的试管菌种中 挑出菌丝，加入少量蒸馏水，进行镜检，看其是否有锁状联合， 没有锁状联合的即为单核菌丝。1.2.3.4 单核菌丝的杂交 由于平菇是异宗的双因子结构，所以将2种异源单核菌株同时接在 PDA平板上，接种点相距 2cm左右，在25C下培养，当2种异源
12、菌丝生长到相互接触时就 很可能发生单核体菌丝融合、核迁移、形成异核体的杂交结果， 所以当 2种异源菌丝生长到一起时，挑取相重叠部位的菌丝体， 将其置于另一平板上培养， 6d 以后在显微镜下观察其结构是否 出现锁状联合。 而后进行亲本与杂交体拮抗试验， 再将其制作成 栽培菌种接种于粪与秸秆发酵料中看其是否出菇， 从而初步判断 融合是否成功。2 结果与分析2.1 对 28 种平菇的拮抗试验 将试验结果与拮抗发生的类型相对比： 异源菌丝生长到一起 时向上隆起，形成脊。背面形成透光差的环形线，有色素沉着。 异源菌丝形成脊；背面具阴影无色素沉着。异源菌丝停止生长。 在培养基表面形成带状隔离区。 反面清澈
13、。 异源菌丝相接处的气 生菌丝顶端扭曲呈球状变形， 无色素沉着。 由于处于不同类群菌 株间是明显存在拮抗的， 所以笔者通过这几种典型的现象初步筛 选出 17 种异源平菇菌株。2.2 对 17 种异源侧耳的模糊综合评价 设定17个待测菌种： (1) 澳黑， (2)平特大 8号， (3)短平， (4) 苏引 6 号， (5) 黑平王， (6) 华平 36， (7) 杂交 16， (8) 白平 5 号， (9)109 ， (10) 平二号， (11) 皑雪， (12) 四季大白， (13)539 ， (14)326 ,15)00412 ,16)801 ,17)优光 1 号，依次为 Y1Y17。 设干
14、物质质量为X1，蛋白含量为X2,漆酶活性X3,日均生长量 X4,长势为X5。见表1。式中X表示第i菌株的第j性状值，MaxXi、MinXi分别表 示该性状值中的最大值和最小值。 U则表示第i菌株第j性状对 MaxXi 的隶属度。根据经验,反映侧耳菌株优劣的某一性状的权重是恒定的, 并可由主观经验确定 X1,权重W1是0.25，X2权重W2是 0.25， X3权重 W3是 0.2,X4，权重 W4是 0.15，x5 权重 W5是 0.15。即 权重集 W=|W1 W2 W3 W4 W5|。见表 2。P(Wj)=刀 mi=IW(Uy)iWi式中P(Wj)是菌株的模糊概率， Wi是权重。表 3 显示
15、， Y5 号菌株最优， Y15 号菌株最差，但利用模糊综 合分析法对菌种做出的优劣评价并不能直接反映菌种在生产上 的优劣，仅供参考。2.3 利用单单杂交技术选育平菇2.3.1 原生质体释放和单核菌丝分离 通过原生质体制备 得到平菇的原生质体。在 28C、酶解3h、酶浓度为1.5 %溶壁 酶时可以得到原生质体的最大释放量，为3.4x107个/ mL效果不错。图 1 为平菇 5 号原生质体释放照片。 通过对单核菌丝的挑 取和培养得到了平菇 Y5号和平菇Y1号的单核菌丝体,见图2、 3。2.3.2 单核体杂交 对所挑出的所有样品进行分析 发现第 8 天挑出的菌丝体经过培养后有锁状联合结构产生（ 图
16、4） 。在与亲本进行的拮抗试验中可以看出，杂交体A7（下端）与2个亲本（上面左右2个分别为Y5号和Y1号）都有拮抗现象（图5）。在 出菇试验中，接种20d后，杂交后的新品种A0713在料表面扭曲 成结，形成菇蕾， 在接入料 29d 杂交后的新品种成功地在鸡粪占 9的鸡粪秸秆发酵料中出菇 （图 6） ，初步表明杂交成功。3 讨论本试验对菌株的初筛采用的是拮抗方法， 虽然可以方便的选 出异源菌株， 但有极少数异源菌株互相没有拮抗效应， 应用分子 鉴定方法才是证明异源性的关键。 本试验全面客观地分析了所搜 集的平菇菌种， 相比原来采用单一或直观判断菌种优劣的方法有 了明显优势。 但是此评价只是在实验
17、室分析的基础上结合统计分 析方法做出的判断，其生产效果还有待观察。本试验对原生质体释放和再生条件的摸索还有欠缺， 用的酶处理时间为3h，比一般得出的结果稍长些。利用单单杂交方式 进行了新菌株的培育， 并且初步取得了成功。 单单杂交技术是一 种原生质技术，其操作简单。实用性强，发展前景广阔。根据是 否含有锁状联合、 亲本和杂交体的拮抗性， 出菇试验只是初步判 断融合子的方法，杂交得到新菌株的物化特性也有待探索。4 结论本试验通过拮抗的方法初筛了 28种平菇菌种，从而得到 17 株异源菌株。通过模糊综合分析法对所选的 17种平菇菌株，通 过干物质质量、蛋白含量、菌丝日均生长量、漆酶活性和长势几 个因素进行综合评价， 得出菌种的优劣次序， 其中得到的 5 号菌 株为最优， Y15 号菌株为最差。利用原生质技术中的单核菌丝杂 交技术培育出A0713菌株，并且通过对 A0713的镜检、A0713和 亲本的拮抗试验、 A07 1 3的出菇试验初步证明融合成功。