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1、一种构建重组质粒的简便方法克隆的道路有很多条，比如TA克隆、不依赖连接反应的克隆（ LIC ）、重组酶依赖的克隆等等。第5页，共28页下一页 返回生物通TA克隆和LIC都需要末端修饰，而这种修饰不容易被凝胶电泳等技术检测。重组酶通常又是和克隆试Anton V.剂盒捆绑销售的，因此研究人员也很难优化重组反应。于是，美国艾默里大学生物化学系的Bryksin和Ichiro Matsumura 开发出一种 PCR介导的克隆方法-重叠延伸 PCR克隆（Overlap extensionPCR cloning ），相当简单且可靠。第5页，共28页下一页 返回克隆过程如下：一开始用嵌合体引物进行PCR扩增，
2、产生了线性的插入片段，且片段两端 都有载体序列。然后将载体和插入片段混合，变性并退火，随后将载体作为模板，用Phusion DNA聚合酶延伸杂交后的插入片段，直到聚合酶到达插 入片段的5端。在几轮PCR循环后，反应的终产 物是带有两个缺口 （每条链一个）的双链融合质粒。 利用Dpnl限制性内切酶消化，除去母板质粒，新 质粒则转化到大肠杆菌中，DNA修复酶将缺口封 住。研究人员在反应中使用的是NEB公司的Phusion DNA 聚合酶，他们认为这很关键，因为 此酶保真度高，且不拥有链置换活性。研究人员还 比较了五种不同的 DNA聚合酶，认为这个最好。 反应中只需要 DNA聚合酶，而不再需要操作多
3、个 限制性内切酶、重组酶、连接酶和糖基化酶等。在原理验证的实验中，研究人员首先克隆了 gfp。他们认为，高浓度的插入片段和相对低的退 火温度（比计算出的退火温度低5-10 C对于高效的重叠延伸是很重要的。转化后的重组子有98% 以上呈绿色，说明克隆错误和原始载体的残留极 低。研究人员还比较了 PCR循环数对克隆效率的 影响。他们发现：在最初 15个循环，重组克隆数 量不断增加，在17-18个循环达到高峰。 之后的循 环导致克隆数量略微下降。随后，他们还比较了三 种不同的载体：插入片段比例（1 : 5、1 : 50和1 : 250 ）。他们发现，1 : 250的比例产生了最多的重 组克隆。他们应
4、用这种克隆方法克隆了4个基因：gfp（1 kb ）、gusA（ 1.9 kb ）、lacZ （ 3.2 kb ）和整 个luxABCDE操纵子（6 kb ）。他们利用限制性酶 切分析和报告蛋白功能来验证了所有重组质粒的 正确结构。此方法的错误率低于3%，而与片段大小无关。不过，研究人员观察到，随着片段长度的 增加，转化后的克隆数量下降。曲线图暗示插入片段的上限是6.7 kb。（生物通薄荷）原文检索：Overlap exte nsion PCR cloning: a simple and reliable way to create recomb inant plasmidsBioTech niques, Vol. 48, No. 6, Ju ne 2010第5页，共28页下一页 返回