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1、第6章增加内容代谢途径调控,通过代谢途径调控的研究可以阐明途径中酶的活性被调节的机理乃至在分子水平上被控制的机理，一旦了解了酶的调节特性，就可以利用代谢控制分析的方法推断途径通量的总体控制，并根据总体通量控制的特点进行网络的优化和菌种的改进。,第六章 代谢途径的调控和代谢控制分析 Regulation of metabolic pathway & MCA,第6章增加内容代谢途径调控,Enzyme kineticsRegulation of enzyme activityRegulation of enzyme concentrationGlobal regulation Metabolic C
2、ontrol Analysis,第6章增加内容代谢途径调控,细胞内代谢途径的调控主要是通过调节参与生化反应的各种物质的浓度来实现的，包括：酶的浓度（转录和翻译）底物的浓度（分解代谢物阻遏等）产物的浓度（终产物反馈抑制和阻遏）调节物分子的浓度（抑制或激活）,代谢途径的调控,第6章增加内容代谢途径调控,代谢途径调控的层次性,原核生物 基因结构简洁有效，无多余序列，必须利用少量的DNA序列充分存储必要的遗传信息 调控层次少，简单而快速：酶活调节-转录和翻译调节-总体调控 能适应多种不利环境，进行快速调节 真核生物 有充分的遗传物质，能形成各种特殊的基因结构 调控层次多而复杂：转录前（DNA扩增、甲基
3、化） 转录（增强子） 转录后（mRNA拼接） 翻译（翻译因子的磷酸化、转铁蛋白等） 翻译后（蛋白质修饰） 对遗传信息传递的准确性和稳定性更有利,第6章增加内容代谢途径调控,分子水平调控 酶的“质”和“量”的调控细胞水平调控 调控代谢子（modulon)或调节子(regulon) 代谢网络的调控(建立代谢调节网络、分析调节网络的特点如拓扑结构、层次性等）,代谢途径的调控的层次性,主要介绍原核生物的调控,第6章增加内容代谢途径调控,酶动力学,单底物的酶催化反应动力学模型: 由V. C .R. Henri 于1902年及L. Michaelis 和M. L. Menten 于1913年建立的。简单的
4、酶催化反应动力学通常是指Michaelis-Menten动力学或饱和动力学。,E+S,ES,E+P,两个假定：1.形成ES复合物的反应速度很快. 2.第二步的逆反应速率可忽略。此假设仅在反应初期产物的累积量很少时才能成立。,第6章增加内容代谢途径调控,米氏方程的推导,快速平衡假设,拟稳态假设,E+S,ES,E+P,ES的解离常数,第6章增加内容代谢途径调控,最适底物的判断：（P204 的推导）,SKm时 ，,SKm时 ，,S = Km时 ，,第6章增加内容代谢途径调控,第6章增加内容代谢途径调控,第6章增加内容代谢途径调控,I=0,I0,竞争性抑制的最终作用结果是使 ，因此降低了反应速度。最大
5、反应速度不变。竞争性抑制可通过提高底物浓度来克服。,Competitive inhibition enzyme kinetics,第6章增加内容代谢途径调控,Non-competitive inhibition enzyme kinetics,非竞争性抑制剂不是底物类似物。抑制剂与酶结合的位点不是酶的活性位点，这种结合降低了酶的有效浓度。高底物浓度不能克服非竞争性抑制。必须加入其它试剂去阻止抑制剂与酶的结合。,I=0,I0,第6章增加内容代谢途径调控,Uncompetitive inhibition enzyme kinetics,反竞争性抑制剂只与ES复合物结合，而且它与酶无亲和作用。 Vm
6、值的降低要比Km值的降低更具显著作用，其最终结果是使反应速率降低。,I=0,I0,第6章增加内容代谢途径调控,Substrate inhibition enzyme kinetics,如果底物自身有抑制作用：一种反竞争抑制，1/v是1/s的双曲函数，该双曲函数具有一垂直和一倾斜渐近线,在低底物浓度时，S2/KSI1，观察不到抑制作用。反应速率为,在高底物浓度时，Km/S1，抑制作用显著。这种情况下反应速率为,第6章增加内容代谢途径调控,P199 Example 6.1,产物是抑制剂的非竞争产物抑制,第6章增加内容代谢途径调控,酶活力调节的方式,酶原的激活（不可逆）可逆共价修饰（磷酸化、酰基化等
7、）活化剂、抑制剂和变构效应的调节激活蛋白质或抑制蛋白质（例如真核细胞中，带有结合态钙离子的钙调蛋白激活许多酶）,第6章增加内容代谢途径调控,变构酶（allosteric enzyme)的特点,具有协同作用的酶别构酶一般具有多个调节位点（效应物）与催化位点（底物）。它们大多是几个亚基聚集而成的多聚体酶，具有四级结构，这些亚基可以不同，也可以完全相同。动力学特征：S型曲线，而不是米氏方程的双曲线协同性(Cooperativity),第6章增加内容代谢途径调控,协同效应 Cooperativity,与一个底物分子的结合引起酶结构的改变，导致剩余结合位点对底物亲和力的升高，随着更多的底物结合，亲和力也
8、越高，称为正协同效应。底物既是反应物，又是调节分子。即底物自身的浓度充当酶活的调节信号，可以在一个较小的底物浓度变化范围内引起酶活的快速、急剧的升高。有利于细胞针对生理环境变化采取快速的调控。,第6章增加内容代谢途径调控,变构调节,一个变构酶的实例：磷酸果糖激酶ADP是活化剂,第6章增加内容代谢途径调控,双曲线表明：M-M动力学方程中r对s的敏感性不高，除非在底物浓度接近零时S型曲线表明： r对s的敏感性在底物浓度接近零时不高，而在正常底物浓度下十分敏感 协同性使变构酶在胞内代谢物处于生理浓度附近（S=Km)起着反应“开关”的作用，对于细胞实现对反应和代谢物浓度的快速调节具有重要意义。,底物同
9、酶的结合具有协同性时，n1。,Hill 经验方程,第6章增加内容代谢途径调控,分支代谢途径中的反馈抑制或激活模式,同工酶反馈抑制累积反馈抑制顺序反馈抑制协同反馈抑制增效反馈抑制抑制加激活,线性代谢途径中的终产物反馈抑制,前体物激活终产物反馈抑制,第6章增加内容代谢途径调控,同工酶反馈抑制,酶I酶II,第6章增加内容代谢途径调控,累积反馈抑制,0.5V(1-20%)=0.4V,第6章增加内容代谢途径调控,顺序反馈抑制,第6章增加内容代谢途径调控,协同反馈抑制,第6章增加内容代谢途径调控,增效反馈抑制,(1-0.85)*0.2=32%,第6章增加内容代谢途径调控,激活和抑制的联合作用,第6章增加内
10、容代谢途径调控,分支代谢途径反馈调节实例,黄色短杆菌中Tyr和Phe协同反馈抑制DAHP合成酶，并存在两种优先合成和激活调节。枯草芽孢杆菌中Tyr、Phe和Trp只抑制其分支途径中的第一个酶，造成分支酸和预苯酸积累，由这两种中间产物抑制DAHP合成酶，属于顺序反馈抑制。,第6章增加内容代谢途径调控,分支代谢途径反馈调节实例,谷氨酸棒杆菌中Lys和Thr对天冬氨酸激酶的协同反馈抑制：如果高丝氨酸脱氢酶缺陷，在补加生长所需的少量Ileu和Thr后，可以解除协同反馈抑制而造成Lys积累,第6章增加内容代谢途径调控,分支代谢途径反馈调节实例,大肠杆菌中天冬氨酸族氨基酸合成的调节三种天冬氨酸激酶，其中两
11、种分别只受赖氨酸和苏氨酸的反馈抑制，而且Lys和Thr还分别抑制其分支途径的第一个酶属于同工酶反馈抑制。,第6章增加内容代谢途径调控,酶浓度的调节,转录的控制 正调控 负调控（底物诱导和终产物阻遏） 弱化机制翻译的控制 反义mRNA mRNA稳定性 翻译起始概率 翻译速率 等,第6章增加内容代谢途径调控,酶浓度的调节 转录的控制,顺式作用元件：对基因表达有调节活性的DNA序列，其活性只影响与其同处于一个DNA分子上的基因，这种序列不编码蛋白质，多位于基因旁侧或内含子中，如：操纵基因、启动子和终止子。反式作用因子：游离基因产物扩散至目标场所的过程称为反式作用，反式作用因子的编码基因与其识别或结合
12、位点的靶DNA序列可不在同一个DNA分子上，如阻遏物、RNA聚合酶等都属于反式作用因子。正调控：若调控蛋白有活性（能和顺式作用元件结合），则受调控基因才能表达。负调控：若调控蛋白失活（不能和顺式作用元件结合），则受调控基因开始表达。,第6章增加内容代谢途径调控,Cell numbers,Time,Glucose,Lactose,二次生长：正调控与负调控的联合作用,葡萄糖比乳糖更迅速地被利用，因此细胞以葡萄糖为碳源时生长比以乳糖为碳源时要快.以葡萄糖和乳糖同时作为碳源时，细胞出现二次生长现象葡萄糖被优先利用，被基本耗尽时，细胞开始合成有关利用乳糖的酶（生长停滞期），将乳糖运入胞内后继续生长。,G
13、lucose,Lactose,Cell numbers,sugar concentration,Catabolite Repression (also called glucose repression),第6章增加内容代谢途径调控,负调控 底物诱导,Lac Operon,诱导物乳糖（或异乳糖）缺乏时，lacI编码的阻遏物具有活性，和操纵基因结合后关闭转录，起负调控作用。,第6章增加内容代谢途径调控,负调控 底物诱导,Lac Operon,存在诱导物乳糖（或异乳糖）时，诱导物充当辅阻遏物，和阻遏蛋白结合使其失活，在cAMP-CRP结合在DNA的前提下，转录起始。,第6章增加内容代谢途径调控,C
14、atabolic Activator Protein (CAP) or cyclic AMP Receptor Protein (CRP) 是乳糖操纵子转录的正调节物。CRP 是一种多效性的正调节物，或总体调节子，可以作用于许多操纵子 活化的CRP 可以和特定的DNA序列结合，并促进RNA聚合酶与启动子的结合CRP 对细胞内cAMP的浓度水平作出响应，并被cAMP活化乳糖操纵子的高表达条件之一是：cAMP-CRP和其上游特定的DNA序列相结合,CRP的简介,第6章增加内容代谢途径调控,正调控Positive regulation of the lac operon,葡萄糖浓度高时，细胞内cAM
15、P浓度很低，CRP无法被激活，即使阻遏蛋白LacI失活，操纵子也不能高表达,第6章增加内容代谢途径调控,正调控 Positive regulation of the lac operon,乳糖操纵子的高表达条件之二是：lacI所编码阻遏物的失活而不能和操纵基因结合,葡萄糖浓度低造成cAMP的大量生成，从而激活CRP启动转录，起正调控作用,第6章增加内容代谢途径调控,负调控 终产物阻遏,当Trp很少时，由trpR编码的阻遏蛋白没有活性，不能和操纵基因结合，转录可以起始。,第6章增加内容代谢途径调控,负调控 终产物阻遏,当Trp大量存在时，阻遏物可以和作为辅阻遏物Trp结合而被激活，然后和操纵基因
16、结合，使转录不能起始。 Trp反馈阻遏的解除使转录强度提高70倍,第6章增加内容代谢途径调控,Cell numbers,Time,Glucose,L-arabinose,大肠杆菌中阿拉伯糖操纵子,Glucose,L-arabinose,Cell numbers,sugar concentration,Time,第6章增加内容代谢途径调控,和乳糖操纵子类似，也由总体调节蛋白 CRP 和一个专一性的调节蛋白 AraC来共同调节AraC既是阿拉伯糖操纵子表达的阻遏蛋白，又是 表达的激活蛋白AraC 可以调节自身的表达可以形成DNA环来对转录进行控制,E.coli阿拉伯操纵子转录调控的特点,第6章增加
17、内容代谢途径调控,P,t,P,t,araC araB araA araD,Activator/ Repressor,I1 I2,AraC dimer,CRP,O2,O1,DNA上有四个AraC结合位点,E.coli 阿拉伯操纵子转录调控的特点,第6章增加内容代谢途径调控,CRP,P,t,P,t,araC araB araA araD,O2,I1 I2,1. 无阿拉伯糖时,O1,O2,I1 I2,O1,repressed,repressed,P araBAD,P araC,过量 AraC 结合在 O1 调节细胞内 AraC 的浓度,E.coli 阿拉伯操纵子转录调控的特点,第6章增加内容代谢途径
18、调控,P,t,P,t,araC araB araA araD,O2,I1 I2,I1 I2,induced(activated),O1,CRP,P,t,O2,O1,P araBAD,2. +诱导物阿拉伯糖 + cAMP-CRP,诱导物阿拉伯糖使AraC二聚体只能和 I2 、 I1 结合，和cAMP-CRP一起使 P araBAD高效转录,E.coli 阿拉伯操纵子转录调控的特点,第6章增加内容代谢途径调控,在大肠杆菌色氨酸操纵子中在存在一种转录的弱化调节，弱化作用的解除可使转录强度升高810倍 转录的mRNA的5端存在一段前导链，通过前导链二级结构的变化、色氨酰-tRNA（色氨酸）以及核糖体的
19、翻译来控制转录是否继续进行,转录的弱化调节 RNA二级结构的调节,大肠杆菌色氨酸操纵子,前导链RNA二级结构受到氨基酰-tRNA分子的调节： His、Trp、Phe等氨基酸操纵子前导链RNA直接感应终端产物的浓度而改变二级结构： THI（B1）-box、RFN （B2） -box和 B12 -box维生素操纵子、嘌呤操纵子等或与其代谢相关的基因，这种调节结构也称为“Riboswitch”,第6章增加内容代谢途径调控,前导链的特点：含有一个起始密码子和一个终止密码子含有两个连续的Trp密码子四段能形成不同二级结构的序列，可以形成终止子结构或抗终止子结构,色氨酸操纵子转录的弱化调节,第6章增加内容
20、代谢途径调控,一旦转录开始后，核糖体结合在前导链上开始翻译，核糖体紧随在RNA聚合酶之后移动。Trp缺乏时，由于大多数色氨酰-tRNA空载，核糖体在两个连续的Trp密码子处暂时停滞或移动变慢，转录出的前导链2、3区配对形成抗终止子结构，mRNA链继续随着RNA聚合酶的移动而延长，直到转录出完整的产物。,色氨酸操纵子转录的弱化调节,第6章增加内容代谢途径调控,色氨酸操纵子转录的弱化调节,Trp充足时，大多数色氨酰-tRNA载有Trp ，核糖体快速通过两个连续的Trp密码子并占据前导链2区的一部分，使2、3区不能配对形成抗终止子，而是3、4区配对，刚好形成终止子结构，mRNA链从RNA聚合酶上脱落
21、下来，转录提前终止。,第6章增加内容代谢途径调控,前导链RFN元件,B.subtilis核黄素操纵子转录弱化,第6章增加内容代谢途径调控,B.subtilis核黄素操纵子转录弱化,FMN和RFN元件对转录的调节,FMN或FAD对核黄素操纵子的转录起调节作用 rib前导区含有RFN元件，可特异地同FMN/FAD结合来感知其浓度。 当FMN/FAD的浓度的较高时， RFN元件与其结合形成一个复合物改变mRNA了的构象，形成抗反终止子结构，导致转录在前导区提前终止，从而抑制核黄素的生成。当FMN/FAD的浓度低于某个水平时，无法形成这样的复合物，这时RNA正常形成反终止子，使转录正常延伸,第6章增加
22、内容代谢途径调控,Riboswitchs,第6章增加内容代谢途径调控,Oliver Schilling1,2, Ines Langbein2, Michael Mller2, Matthias H. Schmalisch1,2 and Jrg Stlke*,1,2 A protein-dependent riboswitch controlling ptsGHI operon expression in Bacillus subtilis: RNA structure rather than sequence provides interaction specificity Nucleic A
23、cids Research, 2004, Vol. 32, No. 9 2853-2864ptsGHI操纵子表达受 GlcT 蛋白调节,RNA感应蛋白质浓度而改变二级结构,第6章增加内容代谢途径调控,翻译的控制,反义mRNA：和mRNA上的糖体结合位点（RBS序列）互补结合，阻断mRNA的翻译Riboswitch：即mRNA对翻译的自调节阻抑蛋白：可以和糖体结合位点或起始密码子结合而阻止核糖体的结合。蛋白质产物的自体负调控：如核糖体蛋白的富集会抑制其自身合成应急调控（Stringent response）：ppGpp对终止rRNA转录、蛋白质合成的调节。mRNA稳定性：自身结构和转录后的修饰作
24、用影响其半衰期。 翻译速率：翻译因子eIF2、 eIF-4E、 eIF-4B的磷酸化调控，加快或减缓翻译速度。,第6章增加内容代谢途径调控,Riboswitch对翻译的自调节,类似于对转录的调节，mRNA前导链也能形成反-反SD序列的二级结构（无效应物时），即SD序列不被掩蔽，核糖体可以进行翻译。或形成反SD序列的二级结构（有效应物时），即SD序列被掩蔽，核糖体不能与其结合。温度也可以充当翻译的调节信号：低温时稳定的二级结构掩蔽SD序列；高温时破坏二级结构，露出SD序列,Listeria.monocytogenes 的prfA 的转录调节Heat-shock 诱导,E.coil中thiM的转录
25、调节效应物：TPP,第6章增加内容代谢途径调控,总体调节,外界条件（如温度、PH、营养状况）产生的信号直接地（通过一个或多个传送器）控制调节分子（调节子）的合成速度。调节子依次控制相应操纵子的蛋白合成速度，来促进生长或维持生存。通过反馈控制机制使系统达到一个新的平衡状态。例子：P104表5.2,总体调节子：在一个总体调节网络中处于一个共同调节蛋白控制下的操纵子网络,第6章增加内容代谢途径调控,总体调节：磷酸化信号转导,细菌中的二元信号转导系统,信息素ComX,传感器ComP,调节子ComA,自磷酸化,磷酸化,启动晚期感受态基因（多操纵子）表达,枯草芽孢杆菌感受态的形成,第6章增加内容代谢途径调控,