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1、水稻品种抗稻瘟病等位基因鉴定及抗瘟新基因的定位和克隆水稻是全世界最重要的粮食作物之 . 。 在水稻生产中 , 病害的发生是威胁生产的重要问题。由真菌灰色巨角间座壳菌(Magnaporthe grisea) 引起的稻瘟病作为最主要的病害之一, 广泛发生于全世界各水稻产区。在我国稻瘟病位于水稻上三大病害之首 , 严重危害时致使水稻产量损失严重, 尤其在晨露时间较长的丘陵地区或山区甚至经常出现绝收的现象, 多年来一直是我国水稻产量及粮食安全的严重威胁。生产实践证明 , 培育持久抗性品种是稻瘟病防控的首要措施。本文通过对水稻主栽品种及育种亲本的抗瘟基因型进行鉴定, 并通过对水稻品种抗稻瘟病新基因 Pi
2、65(t) 的精细定位、克隆和载体构建, 以期了解不同抗病基因在品种中的分布 , 为抗病品种选育及品种布局提供理论依据。1 .辽宁省主栽水稻品种抗稻瘟病的等位基因型鉴定研究选取了辽宁省 24份水稻材料 , 根据 9 个抗稻瘟病基因的保守区设计引物 , 扩增各品种的编码区序列 ,对扩增子序列进行对比分析, 鉴定各基因在24 个品种中的分布情况, 并对部分抗病等位基因进行了功能验证。 结果表明： 辽宁省 24 个主栽水稻品种均不携带Pi36 、Pi37、 Pi21 、 Pit 及其抗病等位基因 , 而 Pid2、 Pid3、 Pita 、 Piz-t 和Pil/Piks/Pikm/Pikp 在 2
3、4个品种中以不同突变类型及不同频率出现, 其中 ,在 2个品种中检测到 Pid2 的抗病等位基因及Pid3 的抗病等位基因； 4 个品种检测到Pita 的抗病等位基因 ,Pita 的等位基因中新发现的几处碱基突变并未影响抗病基因的功能；所有品种中均无与Pik 及其复等位基因完全一致的序列 , 但利用携带 AVR-Pik 的稻瘟病菌接种鉴定结果表明 , 辽粳 454 和沈农 265 携带的 Pik 等位基因可能仍具有抗病基因功能； 在品种中检测到 19 种 Piz-t 的等位基因 , 接种结果表明大部分突变位点均使Piz-t 的等位基因丧失了抗病功能。2 . 港育 129 品种抗稻瘟病新基因 P
4、i65(t) 的精细定位利用辽宁省采集的稻瘟病群体 , 对辽宁省 110 份水稻材料进行抗谱分析 , 结果筛选出连续两年在田间表现高抗 (港育 129)、 高感 (辽星 1 号) 的品种, 经基因型鉴定分析 , 高抗品种中不含有任何已知的抗病基因。利用港育 129和辽星1号构建DH群体，通过SLAF-seq技术将候选区域定位至30.42-30.98M之间，继续通过在BC1F2弋群体中筛选性状分离的个体( 重组体 ), 将候选基因进一步定位至30.42-30.85M 之间 , 该区间内有21个基因，通过RT-PC明析其中有4个基因在港源8号和辽星1号之间表达存在差异。而且在港育129接种稻瘟病菌
5、后 ,4 个基因表达量均显升高 , 说明 4 个基因可能与水稻抗性相关。 4 个基因分别为Os11g0691700、 Os11g0691800、 Os11g0691900、Os11g0692100，均属于 NBS-LRR。由于NBS-LRRfe基因是抗稻瘟病基因中常见的类型，因此认为这些基因很可能是在港育129 中定位到的新基因。 3.Pita 、 Pi9 新等位基因及候选基因Osllg0691700 的克隆和载体构建根据基因型鉴定的结果, 水稻品种辽农979携带的 Pi9 等位基因和港源 8 号所携带的 Pita 等位基因 , 均为新的抗病等位基因。分别从两个品种中克隆基因 , 并将两个基因分别连接至表达载体；利用SLAF-seq技术，在品种港育129中定位到1个和抗病有关的基因Pi65(t),克隆该基因并连接至表达载体。 试验结果表明 ,Pi9 、 Pita 和 Pi65(t) 被成功克隆并连接至表达载体。