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1、,第二章 基因工程常用的工具酶第一节 限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶：简称限制酶。是一类能识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶,寄主细胞控制的限制与修饰系统（R/M体系）！,一、限制酶的种类,限制修饰活性,酶蛋白结构,相对分子质量,切割位点,切割作用辅助因子,实用性,代表,型酶 型酶 型酶,同时存在 单独存在 同时存在,多亚基结构 单亚基结构 两个亚基,30万dal 2-10万dal 、之间,与识别位点不一致 与识别位点一致 与识别位点不一致,Mg2+、ATP、SAM Mg2+ Mg2+、 SAM,低 高 低,EcoK、EcoB Hind EcoP
2、,二、限制酶的命名,命名原则限制酶寄主微生物属名头字母（大写）和种名前两字母（小写）表示寄主物种菌株名位于其后 罗马数字表示同一寄主菌株的不同限制修饰系统,三、型限制酶的特性-识别序列,识别双链DNA分子中特定的4 - 8对核苷酸序列,大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧,部分限制酶能识别多种核苷酸序列,识别序列呈典型的旋转对称型回文结构,回文结构:两条核苷酸链的核酸序列呈双重旋转对称排列的 DNA双螺旋结构,三、型限制酶的特性-切割后形成的末端,粘性末端：,5 GTG AATTCGA 33 CACTTAA GCT 5,平齐末端：,5 GAGG CCGAG 33 CTCC GGCTC 5,彼
3、此具有互补核苷酸的单链延伸末端,三、型限制酶的特性-同尾酶、同裂酶,同尾酶:来源各异、识别序列也不相同，但都产生相同粘性 末端的一类限制酶,5 GTG GATCCGA 33 CACCTAG GCT 5,5 GTT GATCAGA 33 CAACTAG TCT 5,BamHI、 BclI为一组同尾酶,同裂酶:来源各异，但识别相同核酸序列的一类酶,四、影响限制酶活性的因素,DNA的纯度：,蛋白质、苯酚、氯仿、EDTA、SDS,增加限制酶用量扩大酶催化反应体系延长酶催化时间,DNA的甲基化程度：,反应温度：,DNA的分子结构：,酶缓冲液组成：,甘油浓度：,MgCl2：NaCl/KCl：Tris-HC
4、l：-巯基乙醇/二硫苏糖醇（DTT）：牛血清白蛋白（BSA）：,第二节 DNA连接酶,DNA连接酶：能够催化双链DNA片段相邻的3羟基与5磷酸基形成磷酸二酯键的酶,作用特点只能连接双螺旋DNA分子，不能连接单链DNA分子；DNA链上必须具有游离的3-OH和5-P；只能封闭DNA链上磷酸二酯键切口，不能封闭多个核酸分子缺失形成 的裂口；需要吸能：ATP/NAD+,连接方式缺口DNA:平齐末端DNA：粘性末端DNA：,基因工程中常用的连接酶,T4噬菌体DNA连接酶（T4连接酶）大肠杆菌DNA连接酶热稳定性DNA连接酶,第三节 DNA聚合酶,DNA聚合酶：能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类
5、酶,作用特点 能够把脱氧核苷酸分子连续的加到DNA分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合,作用条件脱氧核苷酸原料：四种脱氧核苷三磷酸dNTP（dATP、dTTP、 dCTP、dGTP）引物链：带有3-OH游离基团模板：单链或双链DNA模板Mg2+：,一、大肠杆菌DNA聚合酶 （ DNA pol I ）,酶特性：,53聚合酶活性53核酸外切酶活性3 5核酸外切酶活性,3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,dNTP Mg2+,DNA pol I,3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,5 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH,5 C-G-A-G
6、-T-OH,切口平移反应（Nick translation）,用途：制备32P标记的DNA探针,53核酸外切酶活性5 3核酸聚合酶活性,二、Klenow大片段酶,DNA聚合酶,一个片段： 53核酸外切酶活性另一个片段： 53聚合酶活性、 3 5 核酸外切酶活性,枯草杆菌蛋白酶,Klenow大片段酶特性：53聚合酶活性 3 5 核酸外切酶活性,Klenow大片段酶用途：补平限制酶切割DNA后产生的粘性末端,用32PdNTP对3凹端进行末端同位素标记,cDNA克隆中，合成cDNA第二链应用sanger双脱氧末端中止法进行DNA测序,三、TagDNA聚合酶,来源嗜热水生栖热菌酶特性53聚合酶活性、
7、3 5 核酸外切酶活性耐高温：7580,应用：PCR技术（聚合酶链式反应）,PCR技术,基本原理：类似于细胞内DNA复制过程基本步骤,94变性（1min）,60 退火（1min）,72 延伸（1.5min）,循环1 循环2 循环3,PCR反应的温度循环周期,特点待扩增的DNA链限定在模板上的退火位点之间待扩增DNA链得到迅速大量扩增反应体系组成影响因素,模板dNTPDNA聚合酶引物A、BMgCl2,引物的设计退火温度MgCl2浓度,第四节 DNA修饰酶,一、末端脱氧核苷酸转移酶,末端转移酶（TDT）：在没有模板存在的条件下，能催化 dNTP随机加于DNA分子的3-OH端,AAAAAAAAAAAA OH 3,同聚物尾巴 Poly（dA）,作用底物：,带3-OH末端的单链DNA,带3-OH单链突出末端的双链DNA,带3-OH平齐末端的双链DNA,用途：外源DNA与载体的重组DNA片段3端标记,二、碱性磷酸酶,细菌碱性磷酸酶（BAP）：来自E.coli小牛肠碱性磷酸酶（CIP）：来自小牛肠作用：催化核酸分子脱去5-P,用途：防止载体自身环化5端标记时去磷酸化,三、 T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）,特性：催化-P从ATP分子转移给DNA/RNA的5-OH端作用：5端同位素标记,Thank You !,