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1、金黄色葡萄球菌检验,范 俐,一、生物学特性 菌体形态及培养特征,革兰氏阳性球菌，直径为0.5-1.0微米，镜检时呈单个、成对、四联或不规则的簇群，如葡萄状，故称为葡萄球菌。,大多数菌株最适生长温度30-37，最适pH为7.0-7.5；大多数菌株产生类胡罗卜素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，故称金黄色葡萄球菌。,一、生物学特性 菌体形态及培养特征,兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好；可在15%氯化钠和40%胆汁中生长 一般用含10%氯化钠的胰酪胨大豆肉汤增菌或7.5%氯化钠肉汤增菌。,一、生物学特性 菌体形态及培养特征,所有的毒株产生凝固酶，人和动物来源的菌株通常可凝固
2、兔、人、马和猪的血浆。金黄色葡萄球菌产生磷脂、蛋白酶、脂肪酶和溶菌酶等，大多数菌株可水解天然的动物蛋白并释放脂肪酸。在BP平板产生磷脂环。,致 病 性,金黄色葡萄球菌为条件致病菌，菌株致病力的强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：a.溶血素：外毒素，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；在血平板培养出现溶血环。b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。d.脱氧核糖核酸酶（DNA酶）e.肠毒素：引起急性胃肠炎。,致 病 性,金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原
3、菌，临床表现多种多样，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。,葡萄球菌皮肤感染,致病性,葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾病，可引发不同程度的急性胃肠炎症状，恶心、呕吐最为突出而且普遍，腹痛、腹泻次之。当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8-10小时即可相当数量的肠毒素。,二、检验程序与操作方法,根据中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准：食 品 卫 生 微 生 物 学 检 验 GB 4789.10-94 金 黄 色 葡 萄 球 菌 检 验,检样25g(ml)+225ml灭菌生理盐水,国标
4、：金黄色葡萄球菌检验程序,直接计数方法,增菌培养方法,Baird-parker0.3ml、0.3ml、0.4ml,75氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤,血平板,血平板 ，Baird-parker,涂片染色,观察溶血,血浆凝固酶试验,报 告,36 1 24hr,36 1 24hr,36 1 24hr,检验程序 增菌培养,利用金黄色葡萄球菌耐盐的特性（可耐受15%的氯化钠），用含10%氯化钠的胰酪胨大豆肉汤（见P65）或7.5%氯化钠肉汤增菌。置37摄氏度培养箱培养24小时。,检验程序 分离培养,血平板：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，因此在血平板上产生明显的溶血环。 典型菌落：呈金黄色，有时也为白色，大
5、而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血环。,大而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血环,血平板制作：,成分：豆粉琼脂（或营养琼脂） 100mL，脱纤维羊血（或兔血）5-10mL。制法：加热融化琼脂，冷至50，以无菌操作加入脱纤维羊血或兔血，摇匀，倾注平板。或分装灭菌试管，摆成斜面。,检验程序 分离培养,BP平板：胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、维生素和矿物元素丙酮酸钠是一种生长促进剂亚碲酸盐对除金黄色葡萄球外的其他能分解卵黄的菌株有毒性，并使菌落产生黑色卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环甘氨酸和氯化锂对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。,检验程序 分离培养,在BP平板上典型菌落
6、为：圆形，光滑突起，湿润，直径2-3mm，颜色呈灰色到黑玉色，边缘常为淡色（米黄色或灰色），周围为一混浊带，在其外缘常有一透明圈。用接种针接触菌落似有黄油树胶的粘稠感。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落，其黑色常较典型菌落淡些，且外观可能粗燥，质地较干燥。,B-P平板,检验程序 鉴定之革兰氏染色镜检,革兰氏阳性，球形，组成葡萄状,检验程序 鉴定之凝固酶试验,金黄色葡萄球菌可以产生凝固酶，因此对其鉴别的主要试验是测定其凝固酶。 方法一：试管法 吸取1:4新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球肉浸液肉汤培养物0.5mL，振荡摇匀，放361温箱或水浴内，每半小时观察一
7、次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。,方法二：玻片法在一张洁净玻片中央加1滴生理盐水，用接种环取待检培养物与其混合（设阳性和阴性对照）制成菌悬液，若经1020s内无自凝现象发生，则加入人或兔新鲜血浆1环（不用稀释），与菌悬液混合，观察结果 。也可按P53方法。,兔血浆制备：成分：柠檬酸钠0.106 mol/L（31.3g Na3C6H5O72H2O溶于1L蒸馏水中）制法：一份加兔血9份混合后离心2000rpm，10min吸取上清液即为兔血浆。,葡萄糖肉浸液肉汤的制备：,成分：绞碎牛肉500g，氯化钠5g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾2g，葡萄糖10g，蒸馏水
8、1000mL，pH7.47.6。制法：将绞碎之去筋膜无油脂牛肉500g，与蒸馏水混合后放冰箱24h，除去液面之浮油，隔水煮沸半小时，使肉渣完全凝结成块，用绒布过滤，并挤压收集全部滤液，加水补足原量。加入蛋白胨、葡萄糖，氯化钠和磷酸盐，溶解后校正pH，煮沸并过滤、分装，12130min高压灭菌。,25g样品+ 225ml 生理盐水,5mL样品匀液（1:10）+ 50mL胰酪胨大豆肉汤,血平板,36 1 24hr,镜 检 与肉浸液肉汤培养,血浆凝固酶试验,报告结果,定性检测,36 1 24hr,36 1 24hr,36 1 6hr,BP平板,25g样品+ 225ml 生理盐水,选三个连续梯度，每个
9、梯度分别取1mL接种之至表面干燥的BP平板（如0.4mL，0.3mL，0.3mL）,平板计数（分别记录每种类型的菌落数）,36 1 48hr,血平板、镜 检与 肉浸液肉汤培养,血浆凝固酶试验,报告结果 金葡菌数/g(mL),定量检测（平板法）,每种类型至少选取一个菌落,36 1 24hr,36 1 6hr,适用于检测金黄色葡萄球菌数不小于10/g（mL）的食品计算办法：（三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加）血浆凝固酶阳性数5 稀释倍数,梯度稀释,第一天 器材准备、样品处理、增菌培养 和BP平板分离接种,上午：准备的器材规格名称数量1、250ml三角瓶 1个2、10100mm试管 6支3、1ml移液管 2支4、10ml移液管 2 支5、直径为90mm平皿 8套6、250ml量筒 1支,第一天下午：,（一）样品处理：鱼干、腊肉（二）增菌培养 （三）BP平板制备及分离接种（四）采集兔血的准备：抗凝剂制备、灭过菌的容器和玻璃珠,第二天 接种选择性平板进行分离培养和玻片法血浆凝固酶试验,（一）血平板制备及兔血浆制备（二）接种选择性平板取增菌液1环，划线接种于血平板或BP平板。（三）培养 放于361培养24h。（四）玻片法血浆凝固酶试验,第三天 观察分离结果、镜检和葡萄糖肉浸液肉汤制备及接种,第四天 血浆凝固酶试验（试管法）、实验报告,