《荧光定量PCR之绝对定量分析标准曲线的绘制.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《荧光定量PCR之绝对定量分析标准曲线的绘制.docx（5页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、荧光定量 P C R 之绝对定量分析一一标准曲线的绘制1 .绝对定量定义绝对定量是用浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量.将标准品稀释至不同浓度,作为模板进行PC即应.以标准品拷贝数的对数值为 横坐标,以测得的CT值为纵坐标,绘制标准曲线,对未知样品进行定量时,根据未知样品 的CT值,即可在标准曲线中得到样品的拷贝数.* Log起始浓度与循环数呈线性关系,通过起始拷贝数的标准品可作出标准曲线, 即得到该扩增反响存在的线性关系*由样品CT值,就可以计算出样品中所含的模板量2 .绝对定量标准品标准品的一些标准* 必须用与扩增目的基因相同的引物进行扩增,并且扩增效率相同* 标准品必须是经过准确
2、定量的我们通常用的是ASP-3700紫外光/可见光微量分光光度 计* 标准品必须是标准化的例如,同一化的细胞数* 在每组实验时,必须用相同的阈值设定来确定 CT值标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒 DNA也可以是比扩增片段长的纯化后的PCR物,当然也可以是基因组 DNA甚至cDNA但前提是所有的作为标准品的核酸都必须保证稳定.3 .标准品的制备一般一条标准曲线取四到五个点,浓度范围要能覆盖样品的浓度区间,以保证定量的准确性.一般一个点重复三至五次,对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数.倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液,得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓
3、冲液,得标准品iii1v标准品iii+9v 稀释缓冲液,得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液,得标准品v依次倍比稀释拷贝数的计算：详见核酸拷贝数的计算4 .实例标准品的制作：将标准品依次进行 10倍稀释,ASP-3700测得其拷贝数1.55 X 108copy /ul标准曲线白绘制(1cycle=1min )设置对照：浓度为 1.55 X 107、1.55 X 106、1.55 X 105、1.55 X 104、1.55 X 103、1.55 X 102、1.55 X101的标准样品各一个,设空白对照PCRS应：以不同浓度标准品作为模板标准品的扩增曲线标准品的溶解曲线标准品的标准曲线图X
4、Log7654321YCT值12.0114.8917.9221.1824.5627.8931.25扩增效率(E)计算：E=101/ 斜率=103.23 =2.04, E%=(2.04-1) X100%=104%假设未知中本的CT值为19.11 ,将CT值代入线性方程：即 19.11=34.29-3.23X ,所以 X=(19.11-34.29)/(-3.23)=4.7Quantityunknow=104.7 =50118 copies核酸拷贝数的计算一、分步推理如何计算核酸拷贝数1A260 吸光度值=dsDNA 50ug/ml=ssDNA 33ug/ml=ssRNA 40ug/ml核酸浓度=(
5、OD260)x (dilution factor)x 33 或 40 或 50=ng/ulMM:表 克/摩尔,单位dolton : Idolton即表示1g/mol 1摩尔=6.02x1023摩尔分子拷贝数平均分子量MW dsDNA=a基数x660道尔顿/碱基ssDNA=碱基数X 330 道尔顿 / 碱基ssRNA=gX数X 340道尔顿/碱基得到拷贝数计算公式：6.02x10 23拷贝数/摩尔x 浓度/MW g/mol= copies/ml.即6.02x10 23 x g/ml/DNA length乂 660=copies/ml.或6.02 x 1023 x ng/ul 乂 10-9/DNA
6、 length 乂 660=copies/ul.例：3000碱基质粒,浓度100 ng仙MW=3000bp 660dalton/bp=1.98 X 106daltons ,即 1mol=1.98 X 106g100ng x10-9g/1.98 X 106 =摩尔数copy 数=摩尔数x 6.02 x 1023=3x 101copies/ul.二、这是一个小小的计算器,使你计算更加方便快捷,免去算数之苦 :/ bioask.me/html/541.html什么是拷贝数？ bioask /html/540.html如何计算拷贝数?计算方法：6.02 X 1023拷贝数/摩尔X 浓度 g/ml/ MW g/mol = copies/ml平均分子量MW g/mol : dsDNA=碱基数X 660道尔顿/碱基；ssDNA=碱基数X 330道尔顿/碱基；ssRNA=碱基数X340道尔顿/碱基