《试验四聚丙烯酰胺凝胶电泳.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《试验四聚丙烯酰胺凝胶电泳.docx（3页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、实验四聚丙烯酰胺凝胶电泳实验目的1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及其应用范围；2,熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳相关缓冲液的配制方法.实验原理1.聚丙烯酰胺凝胶简称为PAG的网状结构,具有分子筛效应.它有两种形式：非变性聚 丙烯酰胺凝胶电泳Native-PAGE及十二烷基硫酸钠一一聚丙烯酰胺凝胶 SDS-PAGE; 2,非变性聚丙烯酰胺凝胶,在电泳的过程中,蛋白质能够保持完整状态,并依据蛋白质 的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开.而SDS-PAGE根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质.是一种阴离子去污剂,具有变性和助溶特性,可按一定的比例和蛋白质分子结合成复合 物,并打
2、断蛋白质的氢键和疏水键,使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电 荷,使SDS白质复合物在电泳时的迁移率,不再受原有电荷和分子形状的影响； 可使蛋白质在Tris-甘氨酸缓冲液中,通过电泳的方法别离不同分子量蛋白质或测定蛋 白质分子量的实验技术.实验步骤一相关溶液的制备1.30%丙烯酰胺Acr：称Acr 29g,甲叉双丙烯酰胺Bis 1g,加蒸储水至100mL 过滤后置棕色瓶中,4 c贮存可用1-2月.2. 10%SDS 十二烷基磺酸钠：10g SDS 68c助溶于纯水.3. L Tris-HCl缓冲液：称取,参加50mLzK,用1mol/L盐酸调, 最后用蒸储水定容至 100ml.4,缓冲液
3、：称取,参加50mLK,用1mol/L盐酸调, 最后用蒸储水定容至100mL5. 10%过硫酸钱AP6. TEMED 四甲基乙二胺7. 2 X样品溶解液：L Tris-HCl 1mL , SDS200mg &琉基乙醇 临用前参加,也可以 200mmol/L二硫苏糖醇代替,澳酚蓝 3mg甘油2mL 最后定容至10mL8. 考马斯亮蓝染色液：取 50刈醇溶液90mL冰乙酸10mL混匀,溶解称取考马斯亮蓝 R250 0. 25g 可适当减少,过滤后备用.9. 脱色液： 甲醇300mL,冰乙酸100mL蒸储水定容至1L.10. 5 x Tris-甘氨酸电泳缓冲液：称,甘氨酸 94g,参加50mL 10
4、%SDS加蒸储水使其 溶解后定容至1L.二制胶过程1 .配制别离胶溶液以12% 5mL PAG时例凝胶配制过程要迅速,催化剂TEME改在 注胶前再参加.注胶过程要一次性完成,防止产生气泡.成分参加量TEMED2仙L10%AP50 口10%SDS50 pL30%Acr-BisH2O2 .配制浓缩胶溶液以5% 3mL PAG时例浓缩胶,也成为积层胶,其 pH环境呈弱酸 性,因此甘氨酸解离很少,其在电场的作用下,泳动效率低,导电性较低,由于导电性 与电场强度成反比,在浓缩胶内便形成了较高的电压梯度,压着蛋白质分子聚集到一起,浓缩为一狭窄的区带.当样品进入别离胶后,由于胶中pH的增加,呈碱性,甘氨酸大
5、量解离,泳动速率增加,导电性高,同时由于别离胶孔径的缩小,在电场的作用下, 蛋白根据其分子大小进行别离成分参加量TEMED3仙L10%AP30 p L10%SDS30 p L30%Acr-BisH2O三样品处理、电泳、染色及脱色1 .样品处理：在浓缩胶聚合时,将 2X凝胶上样缓冲液与待电泳样品混合,煮沸 3min, 使蛋白变性.2 .电泳：待浓缩胶聚合完成后约30min,拔下梳子,以蒸储水充分冲洗加样孔,参加 适量样品约15仙L,无样品泳道以1 X凝胶上样缓冲液参加,将电泳装置与电源连 接注意红色正极参加下槽,先根据 8V/cm电压10mA使样品在浓缩胶中泳动,待 澳酚蓝进入别离胶后,加大电压
6、到15V/cm 20mA,直至澳酚蓝进入别离胶底部约4h,停止电泳.3 .染色：电泳结束后,撬开玻璃板,将凝胶板做好标记后放在大培养皿内,参加考马斯 亮蓝染色液染色1小时左右.4 .脱色：染色后的凝胶板用蒸储水漂洗数次,再用脱色液脱色,直到蛋白质区带清楚. 四结果分析相对迁移率= 蛋白样品距加样端迁移距离cm澳酚蓝区带中央距加样端距离cm以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线,量出未知蛋白的 迁移率即可测出其分于量.标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠 性.五考前须知1 . Acr和Bis均为神经毒剂,对皮肤有刺激作用,操作时应戴手套和口罩.2 .玻璃板外表应光滑洁净,否那么在电泳时会造成凝胶板与玻璃板之间产生气泡.3 .样品槽模板梳齿应平整光滑.4 .灌凝胶时不能有气泡,以免影响电泳时电流的通过.5 .切勿破坏加样凹槽底部的平整,以免电泳后区带扭曲.6 .电泳时应选用适宜的电流、电压,过高或者过低都会影响电泳效果.7 .稀释5XSDS/t泳缓冲液至1X浓度灌入电泳槽,需800mL