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1、实验性脑出血大鼠脑内HSP 70与Bel-2的表达魏秀娥，时宏娟，荣良群，沈霞【关键词】脑出血摘要：目的探讨急性脑出血大鼠脑内热休克蛋白HSP70与凋 亡蛋白Bel-2的表达转变。方式成年雄性SD大鼠随机分为生理盐水对 照组与脑出血组(36只)，采纳自体血注入方式成立大鼠脑出血模型。 免疫组织化学法检测HSP70与Bel-2的表达。结果免疫组化示HSP70 与Bel-2在脑内普遍表达,模型组HSP70出血后6h显现阳性细胞表达, 24h有较明显的表达,72h阳性细胞表达仍在增加;Bel-2阳性细胞12h 表达开始增加,48h达顶峰。结论急性脑出血后大鼠脑内HSP70与Bcl-2 表达均增强，二
2、者均以皮质和海马区表达为主。关键词:脑出血;免疫组织化学;大鼠Abstract:ObjectiveToinvestigatetheexpressionofHSP70andBcl-2i nratbrainafteracuteintracerebralhemorrhage(ICH) . MethodsRatswererandomlydividedintoaNScontrolgroupand amodelgroup (n=36each) . ICHmodelwases-tablishedbyinjecting50 U (6h, 12h, 24h, 48h, 72handlwafterintracer
3、ebralhemorrhage), mainlyinthecortexandhippocampusarerelatedtothedegreeof injury，thetimeelapsedandthelocationoftheaffeetedregion.Keywords:intracerebralhemorrhage;immunohistochemistry;rat最近几年来研究说明，细胞凋亡是出血性脑损伤的重要机制 之一，Bel-2是一种凋亡抑制基因，在细胞凋亡调剂中起到重要作用; 而HSP70是一种应激爱惜蛋白，可抑制应激激活蛋白激酶，并发挥其 分子伴侣作用，在线粒体上的HSP70可能通
4、过对变性的细胞凋亡抑制 蛋白Bel-2加以修复或避免其被降解，恢复其凋亡抑制功能lo本 实验拟在探讨此两种蛋白在急性脑出血大鼠脑内的表达转变规律及二 者之间的可能关系。1材料和方式材料动物健康成年雄性SD （Sprague-Dawley）大鼠72只，体重 220250g,由徐州医学院实验动物中心提供。仪器动物立体定位仪（江湾二型）；100 R1微量进样器（浙江省医用器械厂）；KD1508转轮式切片机（浙江金华科迪仪器设 备）；OLYMPUS光学显微镜（日本）。要紧试剂与药品鼠抗Bel-2单克隆抗体与鼠抗HSP70单克隆 抗体（美国SantaCruzBioTech公司产品）；即用型二步法免疫组化
5、检 测试剂盒、DAB显色试剂盒（均为北京中山生物科技产品）；10%水合 氯醛、PBS缓冲液及其他试剂均为国产分析纯级。方式实验动物分组与处置大鼠随机分为对照组（NS组）、模型组 （出血组），时刻点为6, 12, 24, 48, 72h, 1周，每时相点各取大鼠 6只。模型制备参照Yang等2报导的方式改良，依照大鼠脑 立体定位图谱3确信尾状核的位置:前因前，矢状缝向右，深为注 射点。大鼠经10%水合氯醛（）腹腔麻醉俯卧位固定于立体定位仪上, 头皮正中消毒后矢状位切开约，暴露前卤点，据图谱调整立体定位仪 于注射点（，），钻颅打孔（直径约1mm）将鼠尾置于40水温浴lOmin 后掏出擦干消毒，距离
6、鼠尾结尾3cm处剪断，用微量进样器吸取新鲜 血液约50U1,迅速插入己钻好孔内，进针（相当于尾状核位置），注 射时刻很多于15min,留针lOmin后缓慢退针，钻孔用骨蜡封锁,局 部碘伏消毒后，缝合切口皮肤。大鼠清醒后无偏瘫体征（Longa评分） 或血液沿针道反流者弃用。免疫组织化学造模成功后大鼠别离于各时相点经10%水合氯 醛深度麻醉后，经升主动脉快速灌注37c生理盐水100ml,然后以 250nli固定液（4多聚甲醛）灌注固定脑组织，30min内灌完，取全 脑，去除小脑和脑干，置于上述固定液中后固定24h,继入20%、30% 蔗糖液（4）,直至组织块沉底。将固定脑组织放在恒冷切片机上切 取
7、30 U m厚的持续冠状切片，于针道前1mm处向背侧随机隔6片取一 组邻片。HSP70、Bel-2均采纳漂染法，所有操作均按北京中山公司即 用型二步法检测试剂盒说明书进行，脑组织切片用2%H202去离子水排 除内源性过氧化物酶,依次加入一抗（HSP701 ： 150、Bel-21 ： 100）, 二抗试剂盒，各步间以缓冲液振洗，DAB充分显色5min,常规脱色、 透明、封片。以PBS代替一抗做阴性对照。所有结果在10, 20, 40 倍目镜下观看，采纳40倍目镜计数每张脑片4个视野，1只大鼠测2 张脑片，取得8个数值，取其均数为1只大鼠的最终结果。统计学处置采纳统计软件包进行数据分析，各组数据
8、以x 土s表示，两两比较用t查验。2结果血肿形态观看肉目击出血位于右边基底节区，出血灶直径约 34mm,说明造模成功，术后24h见术侧脑弥漫性肿胀，术后第3天 血肿有所吸收，术后第7天明显吸收（图1）。图1大鼠脑出血后血肿形态观看（略）阳性细胞表达特点形态学观看各组大鼠脑组织HSP70与Bcl-2阳性细胞染色均 以胞质有棕黄色物质沉积为主，并可显示细胞轮廓。见图2。图2出血侧大鼠脑组织皮质48h阳性细胞表达（X400）（略）阳性细胞阳性细胞表达时相与部位对照组HSP70偶有表达，模型组以造模后6h 显现阳性细胞表达，术后24h有较明显的表达，术后72h最为显著; 而Bcl-2在造模后12h显现
9、阳性细胞，48h达顶峰。HSP70在脑内普遍 表达，要紧见于海马、纹状体和皮质中;Bel-2阳性神经元集中于出血 侧皮质、海马CA一、CA2区及基底节区;二者在血肿区几乎未见阳性 细胞表达。阳性细胞表达的量见表1, 2o表1各组各时相点血肿周围皮质HSP70阳性细胞数（略）生理盐水组各时相点均见少量阳性细胞表达，组内比 较:P>与同时相点生理盐水组比较表2各组各时相点出血侧皮质Bcl-2阳性细胞数（略）生理盐水组各时相点均见少量阳性细胞表达，组内比较:p>脑出血组与同时相点生理盐水组比较:F<3讨论了解脑内出血后脑损伤的进展关于确信医治方案是很重要 的。实验研究说明，脑内血肿
10、周围及其远隔区域存在缺血，直至全脑 的普遍损害：4o HSP70是生物细胞在各类应激状态下发生热休克反 映所合成的热休克蛋白，其要紧生物学功能是起分子伴侣作用，正常 脑组织中含量较少。在脑出血时，第1天即显现HSP70表达，至少持 续5天，要紧表达部位在血肿周围5, 6,以神经细胞为主。本实验 研究说明，生理盐水组可有少量阳性细胞表达，各时相点无明显不同, 而脑出血后6h显现阳性细胞表达，24h见大量表达，4872h达顶峰, 7天时仍见表达。此与血肿压迫致缺血半暗带形成，诱发HSP70的表 达，从而对神经细胞起到爱惜作用有关。Bcl-2是一种原癌基因，为抗凋亡基因，具有增进细胞生存 的作用，位
11、于凋亡调控基因网络的关键部位7,可抑制细胞程序化 死亡(PCD)o本实验显示,大鼠脑出血后6h偶见阳性细胞表达,48h 达顶峰，Bcl-2的这种转变可能是神经自我爱惜机制之一。与其在脑 出血损伤时抑制氧自由基、阻止促凋亡基因信号传递、抑制Ca2+的释放等有关。既往研究说明，在线粒体参与的胞质程序化死亡的途径中， 表达在线粒体上的HSP70可能通过对变性的细胞凋亡抑制蛋白Bcl-2 加以修复或避免其被降解，恢复其凋亡抑制功能。木实验中，在脑出 血术后第1天，HSP70、Bel-2的表达均增高，第3天达到顶峰，至第 7天减少，与脑组织在第3天损害严峻的转变规律一致。结合既往的 研究:二者均在线粒体
12、上有表达、均有抗氧化损伤作用、对一些调亡刺 激因子引发的细胞调亡均有抑制作用等，综合以上资料，二者在脑出 血抗凋亡作用中似存有协同作用，但具体机制尚待进一步深切研究。参考文献：1 SamaliA, J . ExpCellRes, 1996, 223 (1) : 163-170.2 YangGY , BetxAL ,ChenevertTL ,:relationshipbetweenbrainedema , bloodflow ,andblood-brainbarrierpermeabilityinrats J . JNeurosurg, 1994, 81 (1) :93-102.3包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱M.北京:人民卫生出版社，1991:35.4MatsushitaK,MengW,WangX,J. JCerebBloodFlowMetab, 2000, 20 (2) :396-404.5 MatxPG, SundaresanS, SharpFR, J . JNeurosurg, 1996, 85 (1) :138-145.6 MatzPG, WeinsteinPR, j .Neurosurgery, 1997, 40 (1) :152-162.7 VauxDL , J . ProcNatlAcadSciUSA , 1996 , 93 (6) :2239-2244.8 9